孕婦血清IL-6、sVEGFR-1預(yù)測(cè)早發(fā)型胎兒生長(zhǎng)受限最佳分娩時(shí)機(jī)的臨床價(jià)值*

王 艷，焦 波，文精靈

海南省三亞市婦幼保健院產(chǎn)科，海南三亞 574000

胎兒生長(zhǎng)受限(FGR)具有較高的死胎或胎兒窒息風(fēng)險(xiǎn)以及較差的圍生期結(jié)局[1]；FGR若發(fā)生在妊娠32周及以前則診斷為早發(fā)型FGR，其與晚發(fā)型FGR在臨床表現(xiàn)、與子癇前期的關(guān)系、胎兒結(jié)局等方面有所不同[2]。早發(fā)型FGR增加了早產(chǎn)胎兒窒息的風(fēng)險(xiǎn)，且更易發(fā)生早產(chǎn)兒并發(fā)癥，因此，選擇最佳分娩時(shí)機(jī)對(duì)于平衡胎兒和新生兒風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要[3]。目前，對(duì)于早發(fā)型FGR的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)尚未達(dá)成一致意見(jiàn)，尋找有助于準(zhǔn)確識(shí)別早發(fā)型FGR的孕婦在2周內(nèi)分娩風(fēng)險(xiǎn)的血清分子生物標(biāo)志物尤為重要。早發(fā)型FGR胎盤(pán)血流灌注明顯中斷，進(jìn)而誘導(dǎo)胎盤(pán)中凋亡顆粒的大量分泌。此外FGR孕婦胎盤(pán)膜厚度增加和表面積減少可能導(dǎo)致氧分子在胎盤(pán)膜上的擴(kuò)散受損及分布減少，促使活性氧簇在細(xì)胞內(nèi)毒性積累，進(jìn)而刺激促炎細(xì)胞因子的釋放，引起細(xì)胞損傷甚至凋亡[4]。這些潛在的病理改變機(jī)制為尋找有效的FGR生物標(biāo)志物提供了理論基礎(chǔ)。因此，筆者推測(cè)母體血清中的某些細(xì)胞因子水平變化可能提示胎兒缺氧或母體子癇前期引起的早發(fā)型FGR。本研究旨在利用懸浮芯片技術(shù)分析早發(fā)型FGR孕婦血清細(xì)胞因子譜，并最終篩選可用于預(yù)測(cè)早發(fā)型FGR孕婦分娩時(shí)機(jī)的有效因子。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年4-12月162例在本院經(jīng)產(chǎn)前診斷為早發(fā)型FGR的單胎妊娠孕婦作為FGR組，另外選擇20例胎兒發(fā)育正常的妊娠26～32周的孕婦作為對(duì)照組。2組孕婦年齡、孕周相匹配。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)自然受孕的單胎妊娠；(2)根據(jù)SHINOZUKA等[5]報(bào)道的公式估計(jì)胎兒體質(zhì)量(包括胎兒雙頂葉直徑、胎腹圍和胎兒股骨長(zhǎng)度)，以妊娠26～32周估計(jì)胎兒體質(zhì)量(EFW)低于同孕齡第3百分位數(shù)和臍動(dòng)脈多普勒搏動(dòng)指數(shù)(PI)>95%作為早發(fā)型FGR的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)孕婦末次月經(jīng)時(shí)間或孕周明確。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)多胎妊娠；(2)胎兒存在染色體異常或先天性畸形；(3)合并其他自體免疫性疾病、腎臟疾病、惡性腫瘤或長(zhǎng)期高血壓的孕婦；(4)既往有剖宮產(chǎn)或其他生殖系統(tǒng)手術(shù)史者；(5)未在本院生產(chǎn)者。本研究方案經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有孕婦均簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 在就診當(dāng)天采集所有孕婦血液標(biāo)本5 mL，置于無(wú)菌試管中，4 ℃以3 800 r/min離心10 min，回收無(wú)細(xì)胞上清液，-80 ℃保存待測(cè)。

1.2.2方案1 隨機(jī)選擇FGR組與對(duì)照組各20份血清標(biāo)本，采用Bio-Plex Pro懸液芯片技術(shù)及Bio-Plex Pro多重芯片試劑盒檢測(cè)血清細(xì)胞因子譜，方法如下：標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品使用樣品稀釋劑稀釋。以重組標(biāo)準(zhǔn)品為原料，制備了8點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照組、空白組和待測(cè)標(biāo)本加入到96孔板中，把涂層抗體連接到熒光標(biāo)記的微珠上。將96孔板在室溫黑暗中恒溫孵育1 h，每個(gè)平板洗滌3次，每個(gè)平板加入一個(gè)探測(cè)器，平板在室溫下?lián)u晃30 min。在每個(gè)孔井里加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，在室溫下黑暗中孵化10 min。微珠被懸浮在125 μL的緩沖液中，利用Bio-Rad Bio-Plex 200懸浮芯片系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行量化。采用Bio-Plex處理器6.1軟件對(duì)每份標(biāo)本進(jìn)行自動(dòng)分析和處理。采用斜交旋轉(zhuǎn)對(duì)血清各細(xì)胞因子進(jìn)行分析，根據(jù)細(xì)胞因子載荷的強(qiáng)弱推斷潛在的與FGR相關(guān)的細(xì)胞因子，選擇載荷≥0.6或≤-0.6的細(xì)胞因子(載荷范圍-1～1，表示與觀察變量相關(guān)的回歸系數(shù))用于ELISA試劑盒檢測(cè)。對(duì)于差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的細(xì)胞因子，用于方案2大樣本檢測(cè)。

1.2.3方案2 FGR組剩余標(biāo)本(142例)采用ELISA檢測(cè)血清細(xì)胞因子水平，包括白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、可溶性Fas配體(sFasL)、可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1(sVEGFR-1)、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF)、瘦素、可溶性CD40配體(sCD40L)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1(IGFBP-1)、細(xì)胞膜糖蛋白(CD105)、肝素結(jié)合EGF樣生長(zhǎng)因子(HB-EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)、尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、纖維蛋白溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)、可溶性表皮生長(zhǎng)因子受體(sEGFR)、血管生成素-2(Ang-2)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)。

1.2.4分娩結(jié)局及分組 FGR組均在本院產(chǎn)科行超聲檢查評(píng)估羊水量，每隔24～72 h進(jìn)行臍動(dòng)脈和靜脈導(dǎo)管多普勒超聲檢查(無(wú)或反向舒張末期血流速度)，以確定胎兒最佳分娩時(shí)間。孕婦入院至少每天進(jìn)行心電圖監(jiān)測(cè)。追蹤所有孕婦的分娩結(jié)局，將方案1及方案2中FGR孕婦及新生兒均根據(jù)分娩時(shí)間分為診斷FGR 2周后分娩組、診斷FGR 2周內(nèi)分娩組。小于胎齡兒(SGA)為出生體質(zhì)量低于同胎齡和同性別平均體質(zhì)量第10百分位數(shù)的新生兒。嚴(yán)重SGA被定義為出生體質(zhì)量低于同胎齡和同性別第3百分位數(shù)[6]。

2 結(jié) 果

2.1方案1孕婦一般資料比較 根據(jù)分娩時(shí)間，20例早發(fā)型FGR孕婦分為診斷FGR 2周后分娩組6例、診斷FGR 2周內(nèi)分娩組14例。診斷FGR 2周后分娩組6例中，1例發(fā)生子癇前期，1例在分娩時(shí)舒張末期靜脈血流速度發(fā)生逆轉(zhuǎn)，1例胎心監(jiān)護(hù)CTG異常。診斷FGR 2周內(nèi)分娩組14例中，6例發(fā)生子癇前期，其中1例出現(xiàn)羊水過(guò)少；8例出現(xiàn)胎兒?jiǎn)栴}，其中3例羊水過(guò)少，2例在分娩時(shí)舒張末期靜脈血流速度發(fā)生逆轉(zhuǎn)，7例胎心監(jiān)護(hù)CTG異常。3組孕婦年齡、孕前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、初產(chǎn)婦比例、采樣孕周及新生兒性別比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FGR孕婦2亞組與對(duì)照組比較，早發(fā)型FGR孕婦早產(chǎn)比例、子癇前期比例及新生兒SGA、嚴(yán)重SGA 5 min Apgar評(píng)分<7分的比例均高于對(duì)照組(P<0.05)，早發(fā)型FGR孕婦分娩孕周、新生兒出生體質(zhì)量均低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 方案1孕婦一般資料

2.2方案1孕婦血清細(xì)胞因子分布及血清細(xì)胞因子譜分析 采用斜交旋轉(zhuǎn)對(duì)血清各細(xì)胞因子進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，IL-6、VEGF-A、IL-8、TNF-α、sFasL與羊水過(guò)少有關(guān)；sVEGFR-1、PLGF、瘦素與子癇前期因素有關(guān)；sCD40L、EGF與胎心監(jiān)護(hù)異常因素有關(guān)；IGFBP-1則與臍動(dòng)脈或?qū)Ч莒o脈舒張末期血流缺失/逆流因素有關(guān)，見(jiàn)圖1、表2。

圖1 斜交旋轉(zhuǎn)分析孕婦血清細(xì)胞因子譜的因子空間樣本圖

表2 方案1孕婦血清細(xì)胞因子譜斜交旋轉(zhuǎn)分析因子載荷結(jié)果

分娩因素瘦素sCD40LEGFIGFBP-1CD105HB-EGFTGF-αVEGF-D羊水過(guò)少-0.18-0.260.400.330.150.180.270.08子癇前期0.740.130.190.320.370.180.240.11胎心監(jiān)護(hù)異常0.080.760.720.090.330.050.170.28臍動(dòng)脈或?qū)Ч莒o脈舒張末期血流缺失/逆流0.090.280.300.850.050.070.120.09

分娩因素VEGF-CIL-18uPAPDGFPAI-1sEGFRFGFAng-2羊水過(guò)少0.290.330.20-0.15-0.08-0.16-0.03-0.27子癇前期0.26-0.42-0.150.37-0.210.09-0.16-0.05胎心監(jiān)護(hù)異常0.09-0.21-0.08-0.20-0.30-0.18-0.11 0.25臍動(dòng)脈或?qū)Ч莒o脈舒張末期血流缺失/逆流0.18-0.08-0.11-0.15-0.31-0.09 0.04 0.10

2.3方案1孕婦血清中與FGR分娩因素相關(guān)的細(xì)胞因子水平比較 根據(jù)細(xì)胞因子分析結(jié)果，確定了5種細(xì)胞因子(IL-6、sVEGFR-1、PLGF、sCD40L、瘦素)與FGR分娩因素相關(guān)，采用ELISA測(cè)定這5種細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示，診斷FGR 2周后分娩組、診斷FGR 2周內(nèi)分娩組、對(duì)照組孕婦間血清IL-6、sVEGFR-1、PLGF、sCD40L、瘦素水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他細(xì)胞因子水平在3組孕婦間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 方案1孕婦血清中與FGR分娩因素相關(guān)的細(xì)胞因子水平比較

2.4方案2孕婦一般資料及血清IL-6、sVEGFR-1、PLGF、sCD40L、瘦素水平比較 追蹤分娩結(jié)局，根據(jù)分娩時(shí)間，將方案2中142例FGR孕婦分為診斷FGR 2周后分娩組(40例)、診斷FGR 2周內(nèi)分娩組(102例)，2組孕婦年齡、孕前BMI、初產(chǎn)婦比例、采樣孕周、子癇前期比例、新生兒性別比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與診斷FGR 2周后分娩組相比，診斷FGR 2周內(nèi)分娩組血清IL-6、sVEGFR-1、sCD40L、瘦素水平升高(P<0.05)，而PLGF水平則相對(duì)降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 方案2孕婦一般資料及IL-6、sVEGFR-1、PLGF、sCD40L、瘦素水平比較

組別n早產(chǎn)[n(%)]子癇前期[n(%)]新生兒性別(男/女,n/n)IL-6(x±s,ng/mL)瘦素(x±s,μg/mL)診斷FGR 2周后分娩組 4027(67.50)10(25.00)21/1933.59±12.3024.39±4.55診斷FGR 2周內(nèi)分娩組102102(100.00)43(42.16)59/4347.04±15.1129.68±6.80t/χ2 36.4913.6150.334 5.092 4.585P<0.0010.0570.564<0.001<0.001

續(xù)表4 方案2孕婦一般資料及IL-6、sVEGFR-1、PLGF、sCD40L、瘦素水平比較

2.5影響早發(fā)型FGR 2周內(nèi)分娩的血清細(xì)胞因子的Logistic回歸模型分析 以分娩時(shí)間為因變量，以與FGR分娩因素相關(guān)的細(xì)胞因子為自變量建立Logistic回歸模型，分析結(jié)果顯示，血清IL-6、sVEGFR-1水平增高是診斷FGR 2周內(nèi)分娩的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 影響早發(fā)型FGR 2周內(nèi)分娩的血清細(xì)胞因子的Logistic回歸模型分析

組別n子癇前期[n(%)]新生兒性別(男/女,n/n)出生體質(zhì)量(x±s,g)SGA[n(%)]嚴(yán)重SGA[n(%)]5 min Apgar評(píng)分<7分[n(%)]對(duì)照組200(0.00)12/83 090.00±812.451(5.0)0(0.0)0(0.00)診斷FGR 2周后分娩組61(16.67)a3/32 133.21±510.60a6(100.0)a3(50.0)a0(0.00)診斷FGR 2周內(nèi)分娩組146(42.86)a8/61 451.67±265.82a14(100.0)a11(78.57)a 3(21.43)aF/χ210.4820.19028.210 36.192 23.0526.023P0.0050.909<0.001<0.001<0.0010.049

2.6血清IL-6、sVEGFR-1水平對(duì)早發(fā)型FGR 2周內(nèi)分娩的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清IL-6、sVEGFR-1單獨(dú)預(yù)測(cè)早發(fā)型FGR 2周內(nèi)分娩的曲線下面積AUC分別為0.778(95%CI：0.693～0.864)、0.844(95%CI：0.780～0.908)，最佳臨界值分別為33.875 ng/mL、2 479.09 pg/mL，此時(shí)靈敏度分別為82.4%、82.4%，特異度分別為62.5%、70.0%；IL-6、sVEGFR-1聯(lián)合預(yù)測(cè)早發(fā)型FGR 2周內(nèi)分娩的AUC為0.875(95%CI：0.815～0.936)，靈敏度為86.3%，特異度為75.0%，見(jiàn)圖2。

圖2 血清IL-6、sVEGFR-1水平預(yù)測(cè)早發(fā)型FGR2周內(nèi)分娩的ROC曲線

3 討 論

早發(fā)型FGR是一種常見(jiàn)的產(chǎn)科疾病，其增加了新生兒圍生期窒息、死亡等不良結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)，還可能并發(fā)后遺癥，威脅新生兒的長(zhǎng)期健康[7]。同時(shí)早發(fā)型FGR比晚發(fā)型FGR更易出現(xiàn)因母體血管灌注不良引起的胎盤(pán)組織病理學(xué)病變，因此，篩查早發(fā)型FGR并推測(cè)其分娩時(shí)機(jī)具有重要意義[8]。本研究對(duì)不同孕婦的血清細(xì)胞因子譜進(jìn)行分析，在對(duì)照組與不同分娩時(shí)間的2組早發(fā)型FGR孕婦之間，血清IL-6、sVEGFR-1、PLGF、sCD40L、瘦素水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此，本課題組對(duì)以上因子采用Logistic回歸模型進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示孕婦血清IL-6、sVEGFR-1水平升高是早發(fā)型FGR 2周內(nèi)分娩的獨(dú)立影響因素，為預(yù)測(cè)早發(fā)型FGR孕婦的分娩時(shí)間提供了新的診斷依據(jù)。

早發(fā)型FGR胎兒更易伴有臍血流異常、羊水過(guò)少，從而導(dǎo)致胎兒丟失率升高，因此臨床對(duì)于早發(fā)型FGR常給予密切的胎兒血流及羊水情況監(jiān)測(cè)，但并不能有效預(yù)測(cè)分娩時(shí)間[9]。羊水過(guò)少極易導(dǎo)致胎兒發(fā)育畸形，是誘發(fā)FGR的重要因素之一，且多數(shù)羊水過(guò)少的孕婦分娩孕周要更短。而常見(jiàn)的引起羊水過(guò)少的原因有胎膜早破、胎盤(pán)血流灌注異常及因胎盤(pán)功能差，這些原因致使胎兒水合作用減少、生長(zhǎng)遲緩、胎兒尿流減少[10]。其中細(xì)胞因子水平異常是胎膜早破的常見(jiàn)原因，有研究表明，IL-6、IL-8及TNF-α水平升高會(huì)激活溶酶體酶進(jìn)而破壞胎膜[11]；同時(shí)，胎盤(pán)血流及功能也與炎癥因子水平相關(guān)，在INOUE等[12]的研究中，核苷酸結(jié)合的寡聚域-1(Nod1)會(huì)引起小鼠血管炎癥的發(fā)展，通過(guò)給受孕的C57BL/6小鼠注射N(xiāo)od1配體之一的FK565可誘導(dǎo)孕鼠胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、死亡，且母體、胎盤(pán)和胎兒組織中IL-6、TNF-α水平均明顯增加，說(shuō)明激活Nod1信號(hào)傳導(dǎo)可誘導(dǎo)胎兒免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)等，進(jìn)而對(duì)胚胎的生長(zhǎng)與發(fā)育產(chǎn)生不良影響。RAGHUPATHY等[13]也發(fā)現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限與正常妊娠相比具有更強(qiáng)的促炎傾向性，尤其是對(duì)于胎盤(pán)供血不足或功能不全的孕婦，炎癥相關(guān)因子水平升高更明顯。此外，本研究結(jié)果還顯示，診斷FGR 2周內(nèi)分娩的孕婦血清IL-6水平比診斷FGR 2周后分娩的孕婦更高(P<0.05)，提示IL-6可能有預(yù)測(cè)早發(fā)型FGR分娩時(shí)間的重要價(jià)值。

子癇前期和FGR是2種常見(jiàn)妊娠相關(guān)并發(fā)癥，子癇前期孕婦FGR發(fā)生率為20%～30%，而在早發(fā)型重度子癇前期孕婦中FGR發(fā)生率可高達(dá)60%[14]。sVEGFR-1主要由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，在血管生成中扮演重要角色，VAISBUCH等[15]對(duì)健康孕婦及重度子癇前期、子癇的孕婦sVEGFR-1水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，重度子癇前期及子癇孕婦的sVEGFR-1水平明顯高于健康孕婦，但其二者之間的sVEGFR-1水平并無(wú)顯著差異，故研究者認(rèn)為子癇與重度子癇前期有相同致病途徑，且與sVEGFR-1水平相關(guān)。sVEGFR-1通過(guò)結(jié)合、抑制VEGF、PLGF活性從而達(dá)到抗血管生成的作用，同時(shí)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)促炎因子的敏感性，誘發(fā)血管炎性反應(yīng)，已有研究表明FGR、子癇前期及胎兒死亡的發(fā)生均與抗血管生成狀態(tài)相關(guān)[16-17]。此外，本研究結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)診斷FGR 2周內(nèi)分娩的孕婦血清sVEGFR-1水平比診斷FGR 2周后分娩的孕婦高(P<0.05)。因此，本課題組采用ROC曲線分析血清IL-6、sVEGFR-1水平對(duì)診斷FGR 2周內(nèi)分娩的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果說(shuō)明血清IL-6、sVEGFR-1水平對(duì)診斷FGR 2周內(nèi)分娩有重要意義。但是本研究也存在一定的局限性：首先，多數(shù)孕婦在早發(fā)型FGR診斷2周內(nèi)分娩，導(dǎo)致2組研究隊(duì)列偏倚；其次，孕婦均由同一所研究中心招募；第三，沒(méi)有進(jìn)一步評(píng)估早發(fā)型FGR孕婦血清標(biāo)志物水平與胎兒體質(zhì)量之間的相關(guān)性。因此，下一步計(jì)劃進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)行多重生物標(biāo)志物分析，以提供更具有臨床應(yīng)用價(jià)值的信息。

綜上所述，IL-6和sVEGFR-1與早發(fā)型FGR孕婦分娩時(shí)間有關(guān)，監(jiān)測(cè)孕婦血清IL-6、sVEGFR-1水平對(duì)預(yù)測(cè)早發(fā)型FGR最佳分娩時(shí)機(jī)有重要價(jià)值。