數字細胞成像分析儀DI-60系統對外周血白細胞形態學分類能力的評估*

劉培培，劉佳玉，李興翠，尹可東，梁臻龍，李綿洋

中國人民解放軍總醫院第一醫學中心檢驗科,北京 100853

形態學檢查對技術人員的水平和經驗要求較高，對工作效率以及實驗室標本周轉時間也會產生影響，因此，很多臨床血液實驗室常規并不進行此項檢查[1-2]。但外周血形態學檢查能及時發現一些早期或潛在的血液系統疾病，同時也能對全自動血細胞分析儀的偏差進行糾正，故形態學檢查仍然具有很高的臨床價值[3-4]。數字細胞成像分析儀DI-60系統(簡稱DI-60系統)的出現能較大程度上解決上述問題，但該分析系統的形態學檢查能否完全替代人工鏡檢仍有待進一步驗證[5-6]。本研究擬將DI-60系統和人工鏡檢進行對比，來評價、分析該系統形態學檢查與人工鏡檢結果的一致性，為一些形態學經驗欠缺的技術人員或樣本量較大的實驗室使用該系統提供理論支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據美國臨床實驗室標準協會(CLSI)H20-A2文件，選取2020年8月本中心門診和住院患者130例，從中挑選出顯微鏡下白細胞形態無異常的患者外周血標本100例，其中男54例，女46例。納入標準：(1)年齡0～99歲；(2)3個月內無感染病史，無糖皮質激素或粒細胞集落刺激因子使用史，無急性中毒和急性溶血病史；(3)無腫瘤相關病史；(4)近5年內無手術史；(5)無血液系統疾病(包括貧血、白血病、血小板異常等)；(6)無變態反應性疾病(包括濕疹、蕁麻疹、支氣管哮喘、過敏性皮炎、過敏性鼻炎)，嬰幼兒應注意近期有無食物過敏等；(7)<18歲者2周之內無發熱及罹患各種疾病、嬰幼兒無醫院診斷的先天性疾病和營養不良史；(8)近1周無服藥史(如抗菌藥物等)。排除標準：(1)腫瘤及腫瘤放化療患者；(2)發熱患者；(3)貧血患者；(4)妊娠期或哺乳期婦女，女性月經量過多；(5)慢性理化損傷(如長期暴露于電離輻射環境)或長期接觸化學物質(苯、鉛等)；(6)自身免疫性疾病(如類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡等)。從本中心同期門診和住院患者中選擇287例XN儀器出現白細胞形態異常報警信息的患者標本，其中男145例，女142例，年齡0～85歲。本研究由本院醫學倫理審查委員會批準，檢測的標本為患者常規分析后的標本。

1.2方法

1.2.1制備外周血涂片 采用SP-10自動涂片染色儀自動推片2張(A、B)，并進行瑞氏-吉姆薩染色，其中血涂片A用于檢測，血涂片B作為備用。

1.2.2血涂片人工鏡檢 按《紅細胞和白細胞計數參考方法》[7]，由2名有10年以上血液細胞形態學檢查經驗的技術人員在鏡下分別對血涂片A進行分類，每張血涂片油鏡分類計數200個白細胞，共計400個白細胞,然后取均值。

1.2.3DI-60系統檢測 使用DI-60系統對已閱的血涂片進行血細胞預分析識別，儀器設置為每張血涂片A分別計數100個白細胞和200個細胞，并重復2遍，分別取均值；取均值前均由有10年以上血液細胞形態學檢查經驗的技術人員對預分類結果進行復核。

1.2.4DI-60系統檢測與血涂片人工鏡檢正常形態白細胞的評價指標和數據處理 對于正常形態白細胞血涂片標本，主要關注中性粒細胞(Neut)、淋巴細胞(Lym)、單核細胞(Mon)、嗜酸性粒細胞(Eos)、嗜堿性粒細胞(Baso)5種分類和計數。參照中華人民共和國原衛生部《紅細胞和白細胞計數參考方法》[7](WS/T 245-2005)要求，以人工鏡檢的均值為靶值，DI-60系統分類的每種細胞的均值與靶值比較，根據95%置信區間(95%CI)來進行結果判斷，分析DI-60系統分類與人工鏡檢的符合率；同時以每種細胞的人工鏡檢結果和DI-60系統分類結果作為2個變量進行擬合，以分析二者之間的相關性。

1.2.5DI-60系統檢測與血涂片人工鏡檢異常形態白細胞的評價指標和數據處理 對于異常形態白細胞的血涂片標本，主要關注原始細胞、早幼粒細胞、中幼粒細胞、晚幼粒細胞和異形淋巴細胞5種異常形態類別和計數。去除掉人工鏡檢和DI-60系統均未檢出異常形態白細胞的標本，對有異常形態白細胞檢出的標本分為人工鏡檢檢出例數(Man)、DI-60系統計數100個白細胞檢出例數(DI100)、DI-60系統計數200個白細胞檢出例數(DI200)、DI-60系統計數100個白細胞和200個白細胞2種情況檢出的總例數(DI)、人工鏡檢和DI-60系統均檢出的例數(Man&DI)。按照公式計算：(1)檢出異常形態白細胞的患者總數(Total)=(Man+DI)-Man&DI；(2)人工鏡檢異常形態白細胞的檢出率(Rman)=(Man/Total)×100%；(3)DI-60系統計數100個白細胞時異常形態白細胞的檢出率(RDI100)=(DI100/Total)×100%；(4)DI-60系統計數200個白細胞時異常形態白細胞的檢出率(RDI200)=(DI200/Total)×100%。

2 結 果

2.1DI-60系統檢測與人工鏡檢正常形態白細胞的相關評價

2.1.1DI-60系統檢測與人工鏡檢正常形態白細胞的符合率比較 與人工鏡檢比較，DI-60系統計數100個白細胞和200個白細胞時，Neut、Lym、Mon的符合率均在80%左右，而在計數100個白細胞時，Eos的符合率比計數200個白細胞時低，而Baso的符合率均較低，見圖1。

圖1 DI-60系統計數100、200個白細胞與人工鏡檢符合率比較

2.1.2DI-60系統檢測與人工鏡檢正常形態白細胞的相關性分析 在對正常形態白細胞分類計數時，DI-60系統計數100個白細胞與人工鏡檢Neut、Lym、Mon、Eos、Baso的結果均呈線性正相關(r=0.920 4、0.895 0、0.655 1、0.765 2、0.697 4，P<0.05，圖2)，計數200個白細胞時也與人工鏡檢Neut、Lym、Mon、Eos、Baso的結果呈線性正相關(r=0.935 5、0.925 6、0.655 0、0.783 1、0.719 9，P<0.05，圖3)。

注：A、B、C、D、E分別為DI-60系統計數100個白細胞與人工鏡檢Neut、Lym、Mon、Eos、Baso結果的相關性。圖2 DI-60系統計數100個白細胞與人工鏡檢的相關性

注：A、B、C、D、E分別為DI-60系統計數200個白細胞與人工鏡檢Neut、Lym、Mon、Eos、Baso結果的相關性。圖3 DI-60系統計數200個白細胞與人工鏡檢的相關性

2.2DI-60系統檢測與人工鏡檢異常形態白細胞的檢出情況比較 DI-60系統檢測與人工鏡檢異常形態白細胞的檢出率(RDI100、RDI200、Rman)差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 DI-60系統檢測與人工鏡檢對異常形態白細胞的檢出情況比較

3 討 論

自動化是醫學實驗室發展的必然趨勢，但形態學領域一直是自動化儀器觸碰的禁區。隨著科學技術的發展，特別是近年來AI技術的深入發展和廣泛應用，使得科研工作者有了探索這個“禁區”的底氣；同時隨著精準醫學理論的提出，疾病早發現、早診斷、早治療已成為共識[8]。外周血細胞形態學檢查能及時發現一些早期或潛在的血液系統疾病，但對技術人員的經驗要求較高，且大大增加了工作量，降低了工作效率[9]。DI-60系統能否成為一個解決方案，作為人工鏡檢的有力補充甚至在一定范圍內替代人工鏡檢，是值得關注的問題。因此本研究選取100例鏡下白細胞形態無異常的外周血標本作為研究對象，從符合率和相關性兩個角度對DI-60系統和人工鏡檢進行了比較[10]。

從分類的符合率角度來看，圖1的比對結果表明當DI-60系統計數200個白細胞時，Neut、Lym、Mon和Eos的符合率均達到了80%以上；當DI-60系統計數100個白細胞時，僅Neut的符合率達到了80%以上，但Lym和Mon的符合率(79%和78%)也非常接近80%，雖然相對于DI-60系統計數200個白細胞的符合率低一些，但一定程度上也算具有較好的符合率。在這2種計數情況下，Baso的符合率均較低，分析原因，主要是因為外周血中Baso數量相對較少，導致即使少數細胞識別錯誤，也會對符合率帶來較大的偏差。

相關性分析，一般認為，r的絕對值大于0.8即可表明2個變量之間具有高度相關性，越接近于1，相關性越強。本研究顯示，無論計數100還是200個白細胞，DI-60系統與人工鏡檢Neut和Lym的r均大于0.8，說明DI-60系統與人工鏡檢Neut和Lym具有很高的相關性。但值得注意的是DI-60系統計數100、200個白細胞與人工鏡檢Mon的相關性相對較差。分析原因，很可能是因為Mon在外周血有形成分中是體積較大的細胞，無論是人工還是儀器推片，Mon較容易聚集在涂片邊緣，而DI-60系統掃描區域是一個相對固定的單細胞層區域，這個區域未涵蓋涂片邊緣，因此容易造成Mon計數的系統性偏倚。圖1中DI-60系統計數100、200個白細胞與人工鏡檢Mon的符合率為78%、80%，也可以側面反映這個系統性偏倚的存在，這也是DI-60系統下一步需要重點改進的地方。

對于白細胞異常形態的檢出率，總體來看人工鏡檢與DI-60系統檢出率均較滿意。需要注意的是，早幼粒細胞人工檢出率稍低。本課題組分析發現，可能原因是早幼粒細胞的數量較少，大部分為0%～1%，再加上分片區域不同等隨機因素造成。在原始細胞計數時，其中有3例標本，人工鏡檢在邊緣發現原始細胞，計數僅為1%～3%，但DI-60系統卻未檢出，分析原因很可能是因為DI-60系統閱片區域的設定未涵蓋涂片邊緣和尾部，與上述正常形態中Mon計數的系統性偏倚類似。在日常工作中，血涂片中的異常細胞大多數體積較大，因而容易出現在邊緣和尾部，尤其是白細胞的數值較低時，邊緣和尾部的細胞需更加注意。從DI-60系統計數100個細胞與200個細胞的檢出率來看，雖然100個細胞的檢出率與200個細胞的檢出率差異無統計學意義(P>0.05)，但是根據本實驗組多年的臨床工作經驗，建議在白細胞數值較低時，或者使用DI-60系統分析異常形態白細胞時，應把細胞計數數值設置適當調高，最好設置細胞計數200或200個以上，避免日常工作中對原始細胞等異常細胞的漏檢。在對DI-60系統檢測結果進行簽核時，也發現一些因儀器焦距、角度等儀器成像因素導致個別細胞形態不夠典型，無法確認的情況，這時需要結合人工鏡檢進行判定。綜上所述，對于異常形態的白細胞，DI-60系統檢測與人工鏡檢的表現差異無統計學意義(P>0.05)。

DI-60系統在日常工作中，Neut與Lym計數占外周血白細胞比例較高，而且它能夠將相同類型的所有細胞同時顯示在瀏覽屏幕上，這種對細胞實時的直接的比較給技術人員的簽核帶來便利。因此，大大節省了白細胞分類的時間。自動涂片染色的使用進一步減少了人工工作量，并提高了實驗室的效率。KRATZ等[10]的報告稱，人工使用顯微鏡閱讀每張玻片的平均時間為5.1 min。BRIGGS等[11]進行的計時研究進一步表明，當經驗不足的檢驗技師使用DM96時，使用DM96的時間比人工閱片時間更快。此外，DI-60系統的標本處理速度為每小時30個，還可以設置白細胞分類數量，使漏檢率大大降低。DI-60系統不但可以解決無人閱片或閱片人員不足等問題，還可以解決不同人員、不同實驗室導致的形態學分類標準不一致的問題。DI-60系統中存儲的細胞形態，可以解決各個實驗室人員培訓困難等問題。簽核后的細胞圖像存貯在數據庫中，可以解決形態學電子資料的存檔和查詢問題，方便后期查詢、交流學習、培訓教學。

雖然DI-60系統有諸多優點，但由于涂片受染色、成像等一系列問題干擾，在簽核細胞時，如對細胞形態或者分類有置疑時，必須經顯微鏡人工復核后才能報告。

綜上所述，DI-60系統與人工鏡檢具有較好的符合率和相關性，特別是對于Neut和Lym，雖然其仍存在一定程度的系統偏倚，但可以在一定程度上替代人工鏡檢。