FRD聯合HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測對宮頸上皮內瘤變的診斷意義*

潘智茵，王 剛，林鐵成，謝 詠

1.廣東省佛山市第一人民醫院腫瘤婦科，廣東佛山 528000；2.四川省婦幼保健院婦產科，四川成都 610032

宮頸癌作為一種女性常見的惡性腫瘤，每年新患病人數約50萬，4/5的新發病例位于發展中國家。宮頸癌新發數量占腫瘤總的新發數量的5%，其發病率位于全世界女性所患惡性腫瘤的第2位[1]。每年因宮頸癌死亡的女性約有26萬人之多，其中中、低居民收入的國家病死率最高，我國女性患宮頸癌的發病率和病死率也在逐年上升，宮頸癌正威脅著我國女性的身體健康[2]。宮頸癌的癌前病變為宮頸上皮內瘤變(CIN)，對CIN的早期診斷和治療有利于減低宮頸癌的發病率和病死率。葉酸受體介導的宮頸特殊染色法(FRD)是一種上皮組織染色技術，該方法具有簡單、便捷、無創、價格低的特點，可以對患者快速分流，且易于被患者接受。但是由于其特異性較差，容易出現假陽性，所以尋找一些生物標志物具有重要意義。近年來有研究顯示有諸多分子生物學檢查也可應用于CIN和早期宮頸癌的診斷[3-4]。本研究分析FRD聯合分子生物學指標[高危人乳頭狀瘤病毒(HR-HPV)DNA、人乳頭狀瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA]檢測對CIN的診斷意義，為臨床治療提供科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究采取前瞻性研究，以2018年5月至2020年4月在佛山市第一人民醫院進行診治的200例CIN患者作為觀察組，另選取同期100例健康婦女作為對照組。患者納入標準：(1)所有患者均符合2014年世界衛生組織發布的《CIN Ⅱ～Ⅲ與AIS治療指南》中CIN Ⅱ～Ⅲ級的診斷標準[5]；(2)患者性生活史>1年，無急性炎癥及其他生殖系統禁忌證；(3)患者的卡式評分均在60分以上。排除標準：(1)排除精神異常患者；(2)無法正常溝通患者；(3)哺乳期或妊娠期患者；(4)其他生殖系統疾病患者。觀察組年齡40～49歲、平均(45.57±2.09)歲，平均體質量指數(24.25±2.18)kg/m2；對照組年齡41～50歲、平均(44.64±2.43)歲，平均體質量指數(23.64±2.54)kg/m2。2組研究對象一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經佛山市第一人民醫院醫學倫理委員會論證通過。

1.2方法

1.2.1FRD 對所有受試者取膀胱截石位，使用一次性擴陰器暴露宮頸。宮頸染色：用大棉簽蘸取FRD上皮組織特殊染色液(陜西高源醫療器械有限公司生產)，然后在宮頸表面用力涂抹5圈，再在宮頸外口按壓10 s，取出棉簽并迅速觀察顏色。宮頸管染色：使用專用小棉簽蘸取適量染色液，然后將小棉簽插入宮頸管，深度約為1.5～3.0 cm，并緊貼宮頸管內壁旋轉5圈，取出棉簽并迅速觀察顏色。以棉簽顏色最深的部位作為判斷依據，并采取雙人判讀模式。判斷標準：(1)陽性，棉簽顏色為藍色、藍黑色、藍綠色、黑色；(2)陰性，棉簽顏色為棕色、綠色、淡黃色。

1.2.2分子生物學診斷 (1)HR-HPV DNA測檢：在受試者月經干凈且未有性生活3 d后，使用專用采樣器收集宮頸分泌物，對分泌物中細胞的DNA進行提取，用PCR-反向點雜交技術檢測HR-HPV DNA，所有操作過程嚴格按照HPV基因檢測設備(深圳市亞能生物科技有限公司)說明書手動操作。(2)HPV E6/E7 mRNA檢測：用專用刷收集宮頸表面標本，將所獲標本置入保存管中。采用中美合資Cotia生物技術有限公司生產的Quanti Virus TM診斷試劑盒和Quanti Virus TM冷光儀器，以支鏈DNA技術檢測HPV E6/E7 mRNA，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.3觀察指標 觀察并比較2組受試者及不同病理分級CIN患者的FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7檢測結果，分析CIN的診斷、病理分級與FRD陽性檢出率、分子生物學指標的相關性，分析FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA單獨和聯合檢測對CIN的診斷效能。

2 結 果

2.12組受試者FRD診斷結果比較 FRD檢測CIN的假陽性率為3.00%，假陰性率為8.00%，2組FRD診斷CIN的準確率差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 2組受試者FRD診斷結果比較

2.2不同病理分級CIN患者的FRD診斷結果比較 不同病理分級CIN患者FRD檢測的陽性率差異有統計學意義(P<0.05)；兩兩比較，CIN Ⅱ級、Ⅲ級患者FRD檢測的陽性率均高于CIN Ⅰ級(P<0.05)，CIN Ⅱ級、Ⅲ級陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同病理分級CIN患者的FRD診斷結果比較

2.32組受試者的分子生物學指標檢測結果比較 HR-HPV DNA檢測診斷CIN的假陽性率為1.00%，假陰性率為17.50%；HPV E6/E7 mRNA檢測診斷CIN的假陽性率為1.00%，假陰性率為22.50%。2組HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測診斷CIN的準確率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 2組受試者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果比較

2.4不同病理分級CIN患者分子生物學指標檢測結果比較 不同病理分級CIN患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性率差異均有統計學意義(P<0.05)；兩兩比較，CIN Ⅱ級、Ⅲ級患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性率均高于CIN Ⅰ級(P<0.05)，CIN Ⅱ級、Ⅲ級的陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 不同病理分級CIN患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果比較

2.5CIN診斷、病理分級與FRD、分子生物學指標檢測陽性率的相關性 經Spearman相關分析顯示，CIN診斷、病理分級與FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性率均呈正相關(r>0，P<0.05)，見表5。

表5 CIN診斷、病理分級與FRD、分子生物學指標的相關性

2.6FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA單獨和聯合檢測對CIN的診斷效能 FRD、HR-HPV DNA、HPVE6/E7mRNA聯合檢測診斷CIN的曲線下面積(AUC)、靈敏度和特異度均明顯高于單獨檢測診斷的AUC、靈敏度和特異度(P<0.05)，見表6、圖1。

表6 FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA單獨和聯合檢測對CIN的診斷效能

項目特異度(%)陽性預測值(%)陰性預測值(%)SEAUC(95%CI)PFRD52.0076.3553.6111.2310.775(0.520～0.872)0.017HR-HPV DNA58.0078.7956.861.0270.792(0.762～0.870)<0.001HPV E6/E7 mRNA55.0076.1949.553.2220.692(0.607～0.816)<0.0013項聯合95.0097.4490.480.0270.978(0.762～0.869)<0.001

圖1 FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA單獨和聯合檢測診斷CIN的ROC曲線

3 討 論

宮頸癌前病變無明顯體征，一般認為宮頸癌前病變進展至宮頸癌需要經歷增生、上皮內瘤變、原位癌、早期浸潤癌等階段[6]。為了能夠有效減少宮頸癌的發生，需要及時地發現宮頸癌早期病變并給予及時的治療[7]。在宮頸癌篩查方面，隨著科學技術的不斷發展，存在著多種對CIN的檢測方法，常見的有液基薄層細胞學檢查、HR-HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA等檢查。在長期的應用過程中，上述檢測方法的特異度或靈敏度都有所降低[8]。而FRD檢測作為一種新型宮頸癌前病變的篩查方法，其檢測較為迅速,耗材成本較低，操作簡便并且屬于無創檢測,患者依從性高，易于推廣[9]。

本研究中，FRD檢測CIN的假陽性率為3.00%，假陰性率為8.00%，觀察組與對照組診斷準確率差異無統計學意義(P>0.05)；在觀察組中，隨著CIN患者的病理分級等級升高，FRD檢測的陽性率也升高，該結果與現有研究結果一致[10]。用于FRD檢測的上皮組織特殊染色液是一種活細胞染色劑，由葉酸復合物、亞甲藍等組成，而葉酸受體在正常細胞中較少表達，卻在腫瘤細胞中高表達，且腫瘤細胞與亞甲藍有高度親和性[11]，故可用于CIN的檢測。但FRD檢測ICN有假陽性，其對CIN的診斷有一定的局限性。FRD對CIN的檢測極易受到分泌物和血液的影響，在臨床上單純通過FRD診斷CIN，容易造成假陽性的產生[12]。所以在臨床上通常還對患者的生物標志物進行分析，這對于患者的診斷具有重要價值。由于HPV檢測是一種基于宮頸癌病因學的檢測手段，客觀性強，可重復性高，因此，雖然HPV檢測技術出現較晚，但已逐漸成為宮頸癌前病變的主要初期篩查手段之一[13-14]。本研究結果顯示，不同病理分級CIN患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性率差異有統計學意義(P<0.05)，兩兩比較顯示，CIN Ⅱ級、Ⅲ級患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性率均高于CIN Ⅰ級(P<0.05)，CIN Ⅱ級、Ⅲ級的陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，說明隨著CIN患者的病理分級等級升高，其HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性率也明顯提升。筆者分析認為，在以往的臨床研究中發現，HPV高危感染處是宮頸癌的主要病變部位，90%以上的宮頸癌患者病變區域HPV檢測呈陽性，特別是HR-HPV感染與宮頸癌進展存在密切關系[15]。

FRD檢測屬于形態學檢查的一種，而形態學改變多出現在HPV感染后，且多種因素均能影響形態學特點，進而影響FRD檢測的靈敏度。HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測可以反映機體是否存在HPV感染和病毒癌基因，而對是否存形態學改變不能確定，不能揭示復發及進展情況[16-17]。單獨使用FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測對CIN均具有一定診斷效能，相關性分析結果顯示，CIN的診斷、病理分級與FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率均呈正相關(r>0，P<0.05)。本研究還發現，FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA聯合檢測的AUC、靈敏度和特異度均高于單獨檢測診斷的AUC、靈敏度和特異度(P<0.05)，說明聯合檢測可提高對CIN的診斷效能。但本研究樣本量有限，對于CIN患者的臨床診斷具有一定的局限性，有待在今后的研究中改善。

綜上所述，FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA聯合檢測對CIN具有較高的診斷效能，值得臨床推廣。