補虛活血中藥枸杞子丹參對rd10 小鼠視網膜TNF-α、IL-1β 表達的影響

蔣鵬飛 姚 震▲ 歐 晨 楊毅敬 彭 俊 徐 劍 彭清華▲

1.湖南中醫藥大學中醫學院，湖南長沙 410208；2.湖南省中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護工程技術研究中心，湖南長沙 410208；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院眼科，湖南長沙 410007；4.上海市東方醫院眼科，上海 200120

視網膜色素變性（retinitsi pigmentosa，RP）是一種眼科常見的難治性遺傳性視網膜疾病[1-3]，發病隱匿，多數患者在40 歲左右便喪失有用視力。小膠質細胞是中樞神經系統的免疫細胞，具有抗原提呈、吞噬消化和免疫調節等作用[4-6]，活化的小膠質細胞在一些中樞神經系統的急性損傷中具有促進神經元存活的作用，而在一些慢性損傷中作用卻相反[7-10]。RP 存在神經節細胞的死亡，而這種死亡極有可能由小膠質細胞介導，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是小膠質細胞活化的關鍵靶點，本研究通過檢測rd10 小鼠視網膜中TNF-α、IL-1β 的表達，以期能明確補虛活血中藥枸杞子丹參對RP 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

枸杞中藥超微配方顆粒規格為3 g/袋（相當于臨床成人中藥配方使用量10 g），許可證號：湘20150006，批號：190247，湖南春光九匯現代中藥有限公司生產；丹參中藥超微配方顆粒：規格為2.8 g/袋（相當于臨床成人中藥配方使用量10 g），許可證號：湘20150006，批號：190131，湖南春光九匯現代中藥有限公司生產；維生素A 軟膠囊（批號：140701，青島雙鯨藥業有限公司生產）。

1.2 實驗動物

C57 種系Pde6b 基因突變（Pde6b，-/-）rd10 小鼠40 只，鼠齡4 周，體重18～20 g，購自美國JAX 實驗室，證書編號：NO.1911A11353；C57 野生型（Pde6b，+/+）小鼠8 只，鼠齡4 周，體重20～22 g，由湖南斯萊克景達動物實驗室提供，證書編號：NO.43004700062254。實驗經湖南斯萊克景達動物實驗室倫理審批。

1.3 主要試劑儀器

TNF-α 抗體（abcam 公司，貨號：ab183218）；IL-1β抗體（abcam 公司，貨號：ab254360）；RIPA 裂解液（中國上海碧云天，貨號：P0013B）；mRNA 逆轉錄試劑盒（中國北京康為世紀生物科技有限公司，貨號：CW2569）。搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-92）；恒溫箱（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C）；精密pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司，型號：E-201-C）。

1.4 分組方法

將40 只rd10 小鼠按照隨機數字表法分為五組，每組8 只，分別為模型組、對照組、枸杞組、丹參組、杞參組。8 只C57 野生型小鼠為空白組。每組雌雄鼠分開飼養。

1.5 給藥方法

所有小鼠在SPF 級動物房進行適應性飼養1 周后給予灌胃處理，灌胃28 d，灌胃劑量為20 ml/（kg·d），每天灌胃1 次。模型組和空白組灌胃生理鹽水，對照組灌胃維生素A 溶劑，枸杞組灌胃枸杞子中藥配方顆粒溶液，丹參組灌胃丹參中藥配方顆粒溶液，杞參組灌胃枸杞子加丹參中藥配方顆粒溶液。

1.6 取材方法

灌胃結束后第1 天取材，取材前禁食12 h。10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔注射麻醉動物，75%酒精消毒rd10 小鼠雙眼眼周，用眼科彎組織剪摘除眼球，保存于-80℃冰箱中，供Western blot 及實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測。

1.7 觀察指標及檢測方法

1.7.1 RT-qPCR 法檢測TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達量①提取RNA。將分離好的視網膜約0.02 g 與1 ml Trizol 置于勻漿器充分研磨、混勻，12 000 r/min 離心15 min，離心半徑為95 mm，棄上清，晾干后加入無菌無酶水，待沉淀完全溶解，取2 μl 溶液用于RNA 濃度和純度檢測。②逆轉錄RNA，反應體系（表1）。③RTqPCR 實驗，從NCBI 獲取目的基因序列（表2），采用primer5 軟件設計引物。

表1 逆轉錄反應體系（30 μl）

表2 目的基因序列

1.7.2 Western blot 法檢測TNF-α、IL-1β 蛋白灰度值 ①蛋白樣本提取：將視網膜組織與RIPA 裂解液一同充分研磨，離心后取上清。②制膠。③電泳。④轉膜：打開轉膜夾，按順序鋪好濾紙、NC 膜和膠，清除氣泡。啟動儀器，恒流300 mA。⑤封閉：將轉好的膜取出漂洗，浸入配置好的封閉液中靜置90 min。⑥孵育一抗（表3）。⑦孵育二抗（表4）。每次孵育結束后，1×PBST 洗滌10 min，重復3 次。⑧顯影：將膜轉入ECL 化學發光試劑中孵育1 min，然后吸盡發光液，塑封膜包裹雜交膜，暗盒中X 膠片曝光、顯影。⑨掃描底片，用quantity one 軟件分析灰度。

表3 一抗信息

表4 二抗信息

1.8 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間兩兩比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t 分析。計數資料采用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠視網膜TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達量

與空白組比較，模型組TNF-α、IL-1β mRNA相對表達量升高（P ＜0.05），與模型組比較，枸杞組、丹參組、杞參組TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達量降低（P ＜0.05），與枸杞組比較，杞參組IL-1β mRNA相對表達量降低（P ＜0.05），與丹參組比較，杞參組TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達量降低（P ＜0.05）。見表5。

表5 各組TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達量比較（）

表5 各組TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達量比較（）

注：與空白組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與枸杞組比較，cP ＜0.05；與丹參組比較，dP ＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-1β：白細胞介素-1β

2.2 各組小鼠視網膜TNF-α、IL-1β 蛋白相對表達量

與空白組比較，模型組TNF-α、IL-1β 蛋白相對表達量升高（P ＜0.05），與模型組比較，枸杞組、丹參組、杞參組TNF-α、IL-1β 蛋白相對表達量降低（P ＜0.05），與枸杞組比較，杞參組TNF-α、IL-1β 蛋白相對表達量降低，與丹參組比較，杞參組TNF-α、IL-1β蛋白相對表達量降低（P ＜0.05）。見圖1、表6。

圖1 各組小鼠視網膜目的蛋白表達條帶圖

表6 各組TNF-α、IL-1β 蛋白平均灰度值比較（）

表6 各組TNF-α、IL-1β 蛋白平均灰度值比較（）

注：與空白組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與枸杞組比較，cP ＜0.05；與丹參組比較，dP ＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-1β：白細胞介素-1β

3 討論

古今醫家對RP“虛”的病機認識較為一致[11]，均認為在RP 病程中始終伴隨著“虛損”，彭清華教授率先在國內論證了RP 患者存在虛中夾瘀之證。針對RP 虛中夾瘀的病機，彭清華教授提出以補虛活血法治療RP，前期研究發現補虛活血中藥能誘導RP 動物模型視網膜αB 多肽mRNA 的表達，抑制凋亡相關靶點的表達，進而減少RP 動物模型視網膜感光細胞凋亡，保護視網膜超微結構[12-17]。

實驗研究表明[18-22]，枸杞子能夠通過抗氧化、抗衰老、抗凋亡作用機制起到保護視細胞及視網膜色素上皮細胞的作用。丹參大量應用在與眼底血管相關性疾病的治療中，有研究表明其在減輕視網膜色素上皮光損傷、抑制視網膜色素上皮細胞炎癥增殖等方面也有一定的作用[23]。

大量研究表明小膠質細胞的遷移活化與視細胞凋亡密切相關[24-25]，而TNF-α 和IL-1β 是小膠質細胞活化的關鍵靶點，也是促凋亡因子。本研究顯示，與空白組野生型小鼠比較，rd10 小鼠視網膜TNF-α、IL-1β 蛋白及mRNA 的表達明顯增高，TNF-α、IL-1β 可能是RP 病變中的關鍵分子靶點。本研究以補虛活血代表性藥物枸杞子丹參干預rd10 小鼠，發現枸杞子丹參能明顯抑制rd10 小鼠視網膜中TNF-α、IL-1β蛋白及mRNA 的表達，雖然枸杞子與丹參也能抑制rd10 小鼠視網膜中TNF-α、IL-1β 蛋白及mRNA 的表達，但其效果低于枸杞子與丹參聯用，這提示補虛活血法治療RP 優于單純補虛法或單純活血法。

綜上所述，補虛活血中藥枸杞子丹參治療RP 的機制可能是通過抑制了小膠質細胞活化的關鍵靶點TNF-α、IL-1β，但其具體作用的上下游基因及通路仍然不明確，今后在對補虛活血中藥枸杞子丹參治療RP的機制研究中，可著重觀察其對小膠質細胞的影響，以了解其機制。