淺析藥品微生物限度檢查法的若干影響因素

母 丹

（重慶市生物技術研究所有限責任公司 重慶 401121）

微生物限度檢查法是指檢查非規定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度的方法[1]。反映了藥品從原料、生產工藝、生產設備、生產環境到實驗操作者整個過程的衛生狀況。微生物限度指標是否符合《中國藥典》第四部中的相關規定直接決定著藥品最后合格與否，因而至關重要。下面將對容易引起誤差的幾個影響因素進行分析。

一、分析資料與方法

（一）檢驗資料

通過對2015年到2020年五年時間內，1000種藥品微生物進行限度檢查，其中包含了片劑、顆粒劑、膠囊劑、粉劑。觀察這1000種藥品微生物限度檢查時發生的誤差率及分析發生誤差的影響因素和分布，結果如下表1：

表1 誤差影響因素及分布

由表1顯示可知，微生物限度檢查的影響因素有很多，具體的影響因素將進一步分析。

二、影響因素的分析

（一）操作環境對微生物限度的影響

微生物限度檢查應有單獨的潔凈室，潔凈室內應設有無菌操作臺和空氣凈化系統，應在不低于D級背景下的B級單向流空氣區域內進行[2]，應定期按要求對潔凈室內的潔凈度進行驗證。微生物內容包括空氣中菌落總數、沉降菌、塵埃粒子、浮游菌，操作臺面、潔凈服微生物的檢測等。潔凈室內應帶有緩沖間，將無菌衣、無菌手套、口罩、鞋套放于緩沖間內，緩沖間的門應及時關閉且不能對開。潔凈室內的溫度控制在26℃左右，相對濕度控制在40%-60%之間。每次操作前都應打開紫外線燈進行照射殺菌30min，每次操作前后都應用75%的酒精或其他消毒液擦拭操作臺及可能污染的死角。操作臺應備有天平、酒精燈、火柴、酒精棉球、助吸器等設備。當初次檢驗結果為陽性需要進一步對陽性菌進行鑒定時，應在單獨的潔凈區內，不能與供試品在同一個區域，以免引起交叉污染[3]。

當進行陽性菌接種時，整個過程都應該在酒精燈旁完成。接種時按照以下步驟進行：先燒接種環，待稍微冷卻及時沾取細菌樣品，然后在培養基上劃線接種，最后再給接種環滅菌。當接種時有試管時，一定要給試管口及試管帽進行滅菌，防止污染。

（二）設備及用具對微生物限度的影響

實驗用所有器皿應按玻璃器皿的清洗方法洗干凈烘干備用。用牛皮紙將實驗所用器皿包裹密封后放于121℃的高壓滅菌鍋滅菌30min，滅菌完成后不能立即放置陰冷處，避免因急速冷卻使滅菌物品內蒸汽冷凝造成負壓易染菌[4]，取出后應放置在恒溫培養箱中烘干，待用。高壓滅菌鍋應配有專職人員經培訓考試合格后持證上崗使用，避免使用過程中發生危險。所有儀器設備都應該按要求定期校準鑒定，包括所用設備（天平、壓力容器、水浴鍋、操作臺、振搖器、培養箱等），每次使用都應該填寫使用記錄，并定期進行維護清理。值得注意的是，壓力容器的壓力表和溫度表都應該定期檢驗，以防溫度和壓力出現異常而導致滅菌不徹底從而影響實驗結果。另外對于一些實驗耗材也應該定期校驗，如燒杯、移液管或者加液槍，應注意的是使用加液槍前應該對其進行計量驗證，以保證實驗過程中所加樣品量的準確性。

（三）操作人員對微生物限度的影響

檢驗人員應該經過崗前培訓，考試合格后方能上崗，實驗過程中要始終按照無菌檢查的要求進行。此外操作人員還應該定期進行知識再教育，隨時關注行業新動態，學習新的檢測標準、方法等。檢驗人員的無菌服每次都應進行高壓滅菌處理，禁止把無菌服穿出潔凈區。實驗前用肥皂水按照七步洗手法將手洗干凈，然后用75%的酒精進行消毒，再戴上無菌手套。在緩沖間內換上衣服，戴上鞋套、口罩然后進入潔凈區。檢驗人員在進入無菌室后不要頻繁走動，不能大聲喧嘩及嬉戲打鬧，不要咳嗽及打噴嚏，操作過程中如果需要傳遞物品，應通過傳遞倉。無關人員禁止出入無菌室，減少污染機會。操作人員除了專業素養以外，還應該具備一定的人文素養。操作人員本身應該身體健康，不能有皮膚病及一些傳染疾病，以防污染實驗結果。操作完成后應及時清理操作臺及無菌間，避免滋生細菌污染環境。

（四）培養基對微生物限度的影響

1.培養基的儲存

實驗用培養基的質量，直接影響著實驗結果的準確性。現在的培養基基本采用的是脫水培養基，實驗人員應嚴格按照說明書上的條件進行儲存，防止培養基吸潮結塊。應使用在保質期內的培養基，超過保質期雖未有明顯變化但依然會影響實驗數據。

2.培養基的配置使用

培養基每次應按照供試品的量決定配置的多少，且只能經過一次高壓滅菌。配置好的培養基應保存在2-25℃，避光的環境。滅菌過后的培養基應盡量避免過度加熱，以免造成營養成分破壞。使用前的培養基應放置在（50±2℃）的水浴鍋或培養箱中，以防培養基在供試品稀釋液制備過程中冷凝。按梯度進行制備樣品并加入到相應梯度的培養皿中，然后將培養基緩緩傾倒入培養皿中并輕輕轉動，以便樣品分布均勻。此處培養基的溫度最好控制在45℃左右，因為溫度過高可能殺死待檢品中的細菌，溫度過低又會造成凝固。待培養皿內的培養基冷凝后，把培養皿倒置放于符合培養要求的培養箱內進行培養。

3.培養基的檢查

實驗用的培養基都應按照《中國藥典》第四部通則1101無菌檢查法中的要求做培養基的無菌性檢查，且每批培養基的無菌檢查結果必須為無菌生長方可使用。另外還應按此通則做培養基的靈敏度檢查，需注意的是用于培養基靈敏度檢查的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為0代）[5]。

（五）供試液制備過程對微生物限度的影響

1.供試液的制備

供試品檢驗的整個過程必須符合《中國藥典》中無菌檢測的要求。按照被檢測菌種相關技術要求，按1∶10的比例稱取定量的供試品加入到滅菌后的稀釋液中，再放入均質器中振搖均勻，此溶液為10倍供試液。取1ml混合均勻的10倍供試液加入到9ml滅菌后的稀釋液中，應用助吸器和移液管反復吹打以混勻，此溶液為100倍供試液。按照100倍供試液的方法制備1000倍供試液，三種溶液制備完成后待用。

2.實驗過程

對應三個梯度的供試液準備相應的培養皿，每個梯度需要2個培養皿，計數結果以平均值為準。取1ml上述制備好的供試液加入到相應的培養皿中，需注意每次移取供試液時都應混勻，否則取上清液或沉淀物都將會對實驗結果產生影響。然后再倒入15-20ml溫度不超過45℃的培養基，并使供試液和培養基充分混勻，防止細菌成片或重疊生產，影響計數。從制備供試液到注入培養基操作人員應該熟練迅速完成，整個過程應盡量控制在1h內，因為操作時間過長會導致微生物繁殖或死亡影響結果計數。供試品、稀釋液、培養基必須定量加入，使檢查標準化，以便控制實驗結果[5]，千萬不能估量取樣。應在與供試品制備相同實驗條件下設置陰性對照組且陰性對照組不能生長菌落數，否則本次實驗無效。

（六）樣品的影響

檢測過程中應注意被檢樣品的特殊性，不同的樣品對微生物的影響也會不同。藥品對外來微生物的污染可多可少，種類繁多。注意被檢樣品中抑制微生物生長的成分。根據平時工作經驗發現很多藥品中有抑制微生物生長的成分，在實驗過程中應考慮這一因素。不同樣品對溫度的感知也會出現差別。有的檢品在規定培養溫度下的生長較為緩慢，這時就應該延長培養時間來計數更為準確。在抽取被檢樣品時應具有隨機性、代表性、可疑性。

（七）菌種及菌落計數

不同菌種培養的時間和條件會有所不同，應按相關技術規定培養。菌種計數是以肉眼直接點計，故要求檢驗人員仔細觀察，可以借用放大鏡等外來工具。應選用菌落數在適宜范圍內的培養皿來觀察計數，并取兩個培養皿菌落數的平均值作為該梯度的最后結果。根據藥典規定蔓延生長的培養皿不宜計數，檢驗人員在計數時要注意鑒別培養基的氣泡、供試品沉淀物、顆粒等，應注意培養基邊緣的菌落，以防多計或漏計影響實驗結果。當培養基中菌落數較多不易點計時，可將培養基平均分為四個區域，計數其中一個區域的菌落數然后乘以四作為該平板的最后計數結果。

計數時應注意平板邊緣和瓊脂內的菌落，以防漏記。計數過程中遇到有爭議時可以用放大鏡觀察或者在低倍顯微鏡下直接觀察，亦可挑取可疑菌落涂片后鏡檢，也可以適當地延長培養時間以便觀察計數。

實驗過程中，應嚴格按照規定的時間進行培養。但是當出現蔓延生長趨勢時，菌落總數點計要從24小時開始觀察計數，霉菌、酵母菌從48小時開始觀察計數，最終結果菌落總數還是以48小時計數結果為準，霉菌、酵母菌以72小時計數結果為準。

（八）實驗注意事項

微生物限度檢查的實驗中，操作人員應注意以下幾點：

1.微生物限度檢查不允許復測，均以第一次實驗結果為準。

2.供試品取樣應具有代表性，應按照相關規定的方法取樣再加以混合。

3.整個實驗過程要牢記無菌觀念，以防外來污染。

4.實驗中應做好標記，以防混淆。

5.片劑應用滅菌烘干的乳缽研磨成粉末后再檢測；膠囊劑應加入45℃的稀釋液中并且放置在水浴中保溫、振搖，使膠囊充分溶解后再進行檢測；凝固很快的樣品應在加快操作者的速度，必要時可以考慮加大稀釋倍數。

6.實驗室所用的純凈水應該定期檢驗，應符合實驗用水要求，每次實驗的器皿應及時清洗，實驗室所用消毒劑應經常更換，以防產生耐受菌。

7.為了保證實驗結果的準確性，在對藥品進行微生物檢查實驗前應對檢測方法進行驗證。

三、實驗設計

待測樣品：100g/袋破壁靈芝孢子粉

檢測項目：菌落總數、霉菌、酵母菌、大腸菌群

試劑：平板計數瓊脂培養基 無菌生理鹽水

實驗步驟：1.稱取25g樣品加入到225ml生理鹽水的無菌均質杯中，1000r/min均質2min，制成1∶10的樣品勻液。2.用1ml的無菌加樣器吸取1ml1∶10的樣品沿著杯壁緩慢加入到含有9ml生理鹽水稀釋液的試管中，震蕩試管制成1∶100的樣品勻液。注意加樣時吸頭不要接觸稀釋液面。3.按照“2”的方法制備10倍稀釋液，得1∶1000的樣品勻液。沒增加一個梯度的稀釋液注意標記以防混淆，不同梯度需要換一個吸頭以防污染。4.分別吸取1ml制得的三個梯度稀釋液注入到無菌平皿中，每個梯度2個平皿。再分別吸取1ml生理鹽水注入到2個空白無菌平皿中，作為空白對照。各梯度平皿應做好標記。5.迅速傾倒15-20ml冷卻到45℃±1℃平板計數瓊脂培養基，緩緩轉動平皿使其混合均勻。6.待瓊脂凝固后，將平板翻轉于36℃±1℃生化培養箱中培養48h±2h。7.選取菌落數在30CFU-300 CFU之間的，無蔓延菌落生長的平皿計數菌落總數。低于30CFU的記錄實際菌落數，大于300CFU的可計為多不可計。每個稀釋度的采用兩個平皿的平均值作為最終計數。8.按照菌落總數的操作方法同理操作霉菌和酵母菌，培養基用孟加拉紅培養基；大腸菌群用無菌試管替代平皿，培養基用月桂基硫酸鹽胰蛋白胨。

菌落總數實驗結果如下表2

稀釋度 10-1 10-2 10-3 空白菌落數 10 8 1 1 0 0 0 0平均數 9 1 0 0檢驗結果（CFU/g） 90

霉菌、酵母菌實驗結果如下表3

稀釋度 10-1 10-2 10-3 空白菌落數 0 0 0 0 0 0 0 0平均數 0 0 0 0檢驗結果（CFU/g） ＜10

大腸菌群實驗結果如下表4

稀釋度 LST BGLB 0.1mL（g）×3 - - -0.01mL（g）×3 - - -0.001mL（g）×3 - - -檢驗結果MPN/100g ＜0.3

四、結論

綜上所述，微生物限度檢查的結果受多方面因素的影響，從環境、設備、人員到培養基、供試品、菌種及菌落計數等，每一個環節都有可能影響微生物的最終結果，因此加強對微生物限度檢查實驗過程的質量控制顯得尤其重要，也是今后實驗中保證實驗結果準確性的一個重要手段。