CD24、G蛋白偶聯(lián)受體5及Ki-67在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義

李宗壽，龐家武，江文明，何耀海

（防城港市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 防城港 538021）

結(jié)直腸癌早期通常無(wú)明顯臨床癥狀，僅有部分患者會(huì)出現(xiàn)排便習(xí)慣改變和大便性狀改變等非特異性表現(xiàn)，因此早期不易被察覺(jué)，易延誤治療時(shí)機(jī)。當(dāng)結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)明顯臨床癥狀時(shí)疾病通常已經(jīng)發(fā)展至中晚期，給臨床治療帶來(lái)一定挑戰(zhàn)，同時(shí)對(duì)患者生命安全也產(chǎn)生不利影響。手術(shù)病理檢查是結(jié)直腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但易對(duì)患者造成創(chuàng)傷，應(yīng)用受限[1]。目前，對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤分子水平的檢測(cè)是臨床研究的重點(diǎn)，其能夠?yàn)榘┌Y的診治提供指導(dǎo)依據(jù)。CD24是附著大量N型和O型糖鏈的糖基磷脂酰肌醇結(jié)合性蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)，其在乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、肝癌等病灶組織內(nèi)均呈高表達(dá)[2]；G蛋白偶聯(lián)受體5（Lgr5）是腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)志物，參與腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等過(guò)程；Ki-67是細(xì)胞增殖指數(shù)，能夠標(biāo)記處于分裂增殖狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞[3]。基于此，本研究旨在探討CD24、Lgr5及Ki-67在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析防城港市第一人民醫(yī)院2018年1月至2020年12月收治的200例結(jié)直腸癌患者的臨床資料，分別取其結(jié)直腸癌組織標(biāo)本與結(jié)直腸癌癌旁正常黏膜組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，開(kāi)展本研究。男性115例，女性85例；年齡30～85歲，平均（55.24±3.42）歲；直腸癌110例，結(jié)腸癌90例。診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合《中華結(jié)直腸肛門(mén)外科學(xué)》[4]中結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)手術(shù)病理檢查確診者；在實(shí)施手術(shù)前均未采取放射治療或化學(xué)藥物治療者等。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料缺失者；合并結(jié)直腸其他疾病者；存在腸道嚴(yán)重感染者等。本研究經(jīng)防城港市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢驗(yàn)方法 全部標(biāo)本均實(shí)施免疫組化檢測(cè)：使用10%中性福爾馬林溶液將組織標(biāo)本進(jìn)行固定，常規(guī)制作石蠟組織連續(xù)切片，厚度為3 μm，貼附在預(yù)先處理的載玻片上，放置在60 ℃干燥箱內(nèi)，烘烤2 h后，室溫保存；脫蠟、脫水處理：先將石蠟切片放置在60 ℃干燥箱內(nèi)預(yù)熱20 min，之后依次快速放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ缸內(nèi)各15 min，再放入無(wú)水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、75%乙醇中各5 min，磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）浸泡兩次，每次5 min；阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；抗原抗體修復(fù)；封閉非特異性抗原；孵育抗體一抗（CD24一抗為羊抗人CD24多克隆抗體，最佳濃度為1∶200；Lgr5一抗為濃縮型兔抗人Lgr5多克隆抗體，最佳濃度為1∶100；Ki-67一抗為Ki-67鼠抗人單克隆抗體，最佳濃度為1∶100）、二抗；配置二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，親和素生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）液各1滴約50 μL，加入1 mL雙蒸水混勻，在顯微鏡下控制顯色時(shí)間，觀察切片組織顏色和強(qiáng)度適中后，立即使用自來(lái)水終止顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核5 min，中性樹(shù)膠封片。利用全自動(dòng)免疫組化染色儀（上海涵飛醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：Condor11型）檢測(cè)CD24、Lgr5及Ki-67表達(dá)水平。通過(guò)顯微鏡了解細(xì)胞染色情況，同時(shí)統(tǒng)計(jì)其表達(dá)情況。所有病理切片經(jīng)免疫組化染色后均由兩名病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片。

1.3 觀察指標(biāo) ①分析結(jié)直腸癌組織中CD24、Lgr5及Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率。免疫組化染色結(jié)果：在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片顯色情況，其中CD24表達(dá)主要表現(xiàn)為腺體細(xì)胞膜染色，同時(shí)胞漿會(huì)有少量染色，出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒狀屬于陽(yáng)性染色；Lgr5的表達(dá)以胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性染色；Ki-67以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。高倍鏡下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，進(jìn)行視野內(nèi)腺體細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算CD24、Lgr5及Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。細(xì)胞無(wú)著色為（-）；＜25%的細(xì)胞著色為（+）；25%～50%的細(xì)胞著色為（++）；＞50%的細(xì)胞著色為（+++）[5]。②分析CD24、Lgr5及Ki-67陽(yáng)性表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[ 例(%)]表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中CD24、Lgr5及Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率 結(jié)直腸癌組織組中CD24、Lgr5及Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于結(jié)直腸癌癌旁正常黏膜組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。CD24在結(jié)直腸癌細(xì)胞的胞漿及胞膜內(nèi)均有廣泛表達(dá)，見(jiàn)圖1-A；Lgr5在結(jié)直腸癌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)有廣泛表達(dá)，見(jiàn)圖1-B；Ki-67在結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)有廣泛表達(dá)，見(jiàn)圖1-C。

表1 結(jié)直腸癌組織中CD24、Lgr5及Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率分析[ 例(%)]

圖1 結(jié)直腸癌組織CD24、Lgr5及Ki-67免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性圖片（×200）

2.2 結(jié)直腸癌組織CD24、Lgr5及Ki-67表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織CD24陽(yáng)性表達(dá)患者中≥ 40歲、發(fā)生結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移及低分化的患者占比均顯著高于CD24陰性表達(dá)患者；結(jié)直腸癌組織Lgr5陽(yáng)性表達(dá)患者中低分化患者占比顯著高于Lgr5陰性表達(dá)患者；結(jié)直腸癌組織Ki-67陽(yáng)性表達(dá)患者中發(fā)生結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移及低分化的患者占比均顯著高于Ki-67陰性表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2、3、4。

表2 結(jié)直腸癌組織CD24表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[ 例(%)]

表3 結(jié)直腸癌組織Lgr5表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[ 例(%)]

表4 結(jié)直腸癌組織Ki-67表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[ 例(%)]

3 討論

既往臨床針對(duì)結(jié)直腸癌多采用超聲技術(shù)輔助診斷，但該檢查對(duì)影像學(xué)醫(yī)師的操作技能與診斷水平具有較強(qiáng)的依賴性；CT檢查無(wú)法對(duì)直腸壁病灶組織對(duì)周圍肌層的侵犯程度予以準(zhǔn)確顯示[6]。故臨床開(kāi)始積極探索更為科學(xué)合理的診斷方式。隨著臨床對(duì)結(jié)直腸癌研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)基因突變是分子發(fā)病機(jī)制，并且在疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中均有多基因參與。因此，了解細(xì)胞增殖標(biāo)志物水平，對(duì)診斷結(jié)直腸癌具有積極意義。

腫瘤干細(xì)胞是在惡性腫瘤組織內(nèi)具有無(wú)限增殖、自我更新及多向分化潛能的少量腫瘤細(xì)胞，在惡性腫瘤的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮干細(xì)胞作用，能夠形成各種分化程度的腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞，是維持惡性腫瘤組織形成、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及腫瘤耐藥的根源，其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著決定性作用。通過(guò)對(duì)腫瘤干細(xì)胞實(shí)施加工，可獲得較多有臨床價(jià)值的標(biāo)志物，并且檢測(cè)標(biāo)志物水平可對(duì)腫瘤疾病判斷以及治療提供指導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織組中CD24、Lgr5及Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于結(jié)直腸正常黏膜組織，且在結(jié)直腸癌組織組中，CD24和Lgr5陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于Ki-67，表明在結(jié)直腸癌組織中，CD24、Lgr5及Ki-67均呈高表達(dá)，且尤以Lgr5高表達(dá)為主，CD24、Lgr5以及Ki-67在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展方面發(fā)揮一定作用，能夠?yàn)榕R床結(jié)直腸癌早期診斷提供依據(jù)。

CD24屬于黏附分子，其主要是利用糖基磷脂酰肌醇對(duì)細(xì)胞膜實(shí)施錨定，具有多個(gè)N- 或O- 連接的糖基化位點(diǎn)；并且CD24分子在進(jìn)化中獲得更多絲氨酸以及蘇氨酸殘基，使其成為更典型的黏蛋白樣膜表面黏附分子[7]。P- 選擇素是CD24已經(jīng)被識(shí)別的唯一配體，通過(guò)低聚糖同CD24特異性結(jié)合，在生理狀態(tài)下，CD24能夠介導(dǎo)單核細(xì)胞或中性粒細(xì)胞黏附在表達(dá)P- 選擇素活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞及血小板上，抗P- 選擇素或抗CD24抗體能夠阻斷該種黏附作用，而在病理狀態(tài)下，CD24介導(dǎo)癌細(xì)胞同活化血小板和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，故而，推測(cè)CD24可能同腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移相關(guān)，進(jìn)一步可推測(cè)CD24表達(dá)增強(qiáng)發(fā)生在結(jié)直腸癌腫瘤多級(jí)演進(jìn)過(guò)程中的早期階段，同時(shí)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲及淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程，支持細(xì)胞快速增殖和侵襲，有較強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及侵襲能力，且其表達(dá)增強(qiáng)，表明腫瘤細(xì)胞惡性程度高，預(yù)后較差[8]。目前，國(guó)內(nèi)相關(guān)學(xué)者結(jié)合國(guó)內(nèi)實(shí)際病例情況將大腸癌篩查的年齡定為40歲，其認(rèn)為超過(guò)40歲是息肉癌變的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素[9]。隨著年齡的增長(zhǎng)，人體胃腸道功能逐漸減退，再加上高齡群體機(jī)體活動(dòng)較少、缺乏鍛煉，若飲食不當(dāng)則容易出現(xiàn)便秘等情況，對(duì)結(jié)直腸黏膜造成損傷，從而增加癌變的風(fēng)險(xiǎn)。本研究中，結(jié)直腸癌組織CD24陽(yáng)性表達(dá)患者中≥ 40歲、發(fā)生結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移及低分化的患者占比均顯著高于CD24陰性表達(dá)患者，提示CD24表達(dá)增強(qiáng)發(fā)生在結(jié)直腸癌腫瘤形成的早期階段，且其表達(dá)與年齡因素有關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)CD24陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移及低分化密切相關(guān)。

Lgr5屬于一種7次跨膜G蛋白，可在生殖器官及大腦中分布，其水平同Wnt信號(hào)通路存在一定關(guān)系，在Wnt通路中，Lgr5具有靶細(xì)胞作用，當(dāng)其水平出現(xiàn)異常時(shí)，則提示細(xì)胞存在過(guò)度增殖和分化，其可參與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展，其表達(dá)水平是反映結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生的重要早期指標(biāo)[10-11]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌Lgr5陽(yáng)性表達(dá)中低分化的患者占比顯著高于Lgr5陰性表達(dá)，表明了Lgr5在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，與腫瘤侵襲性相關(guān)。Ki-67屬于核蛋白，是一種細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，同核糖體RNA轉(zhuǎn)錄有一定關(guān)聯(lián)，其在細(xì)胞增殖的各個(gè)階段均存在表達(dá)，并且在細(xì)胞有絲分裂后水平快速下降，但是在細(xì)胞靜止期無(wú)表達(dá)；Ki-67陽(yáng)性表達(dá)越高，提示Ki-67介導(dǎo)的細(xì)胞增殖同結(jié)直腸癌的分化程度、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)[12-13]。本研究結(jié)果也顯示，結(jié)直腸癌Ki-67陽(yáng)性表達(dá)中發(fā)生結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移及低分化的患者占比均顯著高于Ki-67陰性表達(dá)，表明Ki-67在結(jié)直腸癌進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，且表達(dá)水平高提示腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，患者預(yù)后不良。

綜上，在結(jié)直腸癌中，CD24、Lgr5以及Ki-67均呈高表達(dá)，且CD24、Lgr5及Ki-67表達(dá)水平與患者臨床病理特征關(guān)系密切，可將其作為協(xié)助結(jié)直腸癌診斷和治療的重要指標(biāo)，通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)上述3項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)情況，可提升臨床結(jié)直腸癌診斷水平。但本研究也存在一定不足之處，未對(duì)患者疾病治療與預(yù)后情況進(jìn)行隨訪，因此在上述3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢查應(yīng)用在治療與預(yù)后判斷方面的意義還未能完全掌握，尚需擴(kuò)大樣本量，延長(zhǎng)隨訪周期，對(duì)疾病治療及預(yù)后情況做深入研究。