鐵皮石斛聯合二甲雙胍對2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝小鼠的改善作用和機制研究

梁鈺華，李志家，鄧曉冬，楊育輝

（1.廣州市番禺區中心醫院藥學部；2.廣州市番禺區中心醫院內科，廣東 廣州 511400）

非酒精性脂肪性肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）指的是一類與酒精或其他肝臟受損因素無關的肝臟代謝性疾病，隨著對NAFLD的研究深入，發現其與代謝疾病2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）在發病機制和發病因素間具有較多相似處，肝臟脂肪過量積累表現形式是NAFLD，胰島素長期分泌不足的表現形式是T2DM，與正常人相比，T2DM患者更易罹患非酒精性脂肪性肝病。目前臨床上治療T2DM的常用藥物是二甲雙胍，NAFLD的臨床用藥則為二甲雙胍、熊去氧膽酸、吡格列酮等，雖然二甲雙胍可同時治療T2DM與NAFLD，但患者對二甲雙胍的依賴容易導致體內胃、心臟和肝臟等重要器官和部位的功能受損[1]。鐵皮石斛具有益胃生津，滋陰清熱之功效，可發揮抗癌、抗氧化、保護肝臟、降糖等作用，在臨床上被用來治療糖尿病、肝臟病、腎病等疾病；且相關研究顯示，鐵皮石斛中多糖能夠顯著提高糖尿病小鼠肝臟和胰腺的抗氧化能力，修復肝臟和胰腺氧化損傷，從而提高胰島素含量和緩解胰島素抵抗，具有降血糖的作用[2]。因此，本研究旨在探究鐵皮石斛聯合二甲雙胍對T2DM合并NAFLD小鼠肝功能與血脂水平的影響，并探究其作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要藥物、試劑及儀器

1.1.1 實驗動物 C57BL/6J小鼠50只，均為雄性，體質量22～25 g，平均（23.41±0.26） g；小鼠均4周齡。所選動物均由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（粵）2018-0002。實驗過程中對動物的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》[3]的要求。

1.1.2 主要藥物與試劑 鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma-Aldrich，CAS No18883-66-4，規格：500 mg）；鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H20023370，規格：0.5 g/片）；鐵皮石斛（廣州至信中藥飲片有限公司）；SDS-PAGE凝膠試劑盒（碧云天生物技術公司）；蛋白免疫印跡實驗（WB）用3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（Cell Signaling Technology）；三酰甘油（TG）試劑盒、總膽固醇（TC）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒及葡萄糖（Glu）試劑盒（中生北控生物技術公司）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）與天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；實時熒光定量試劑盒（日本TaKaRa BIO株式會社）；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）實驗用引物（上海生工生物科技有限公司）；細胞組織快速裂解液RIPA（美國賽默飛世爾科技公司）；酪氨酸激酶2（Tyk2）蛋白一抗、信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）蛋白一抗（上海澤葉生物科技有限公司）等。

1.1.3 主要儀器 WB實驗用電泳儀（Bio-Rad Laboratories，型號：Universal）；顯影儀（Bio-Rad Laboratories，型號：ChemiDoc XRS）；全波長酶標儀（美國伯騰儀器有限公司，型號：InfiniteM 1 000 Pro）；熒光基因擴增儀（美國賽默飛世爾科技公司，型號：ABI quantstudio5）；超微量紫外分光光度計（瑞士梅特勒- 托利多科技公司，型號：UV5 Nano）；全自動生化分析儀（Roche Diagnostics GmbH，型號：cobas e411）等。

1.2 制模與檢測方法

1.2.1 制模方法 動物適應性飼養后，隨機取10只設為正常組，進行普通飼料喂養。另40只運用高糖高脂飼料喂養12周建立T2DM合并NAFLD模型。光鏡下可見肝細胞呈中度彌漫性脂肪變性可判定為NAFLD模型，進一步腹腔注射STZ，72 h后以連續3 d空腹血糖≥ 11.1 mmol/L即可判定T2DM合并NAFLD模型成功建立[4]。將40只T2DM合并NAFLD小鼠隨機分成模型組、石斛組、石斛聯合二甲雙胍組、二甲雙胍組，每組10只。石斛組小鼠灌胃石斛400 mg/(kg·d)，石斛聯合二甲雙胍組小鼠灌胃鐵皮石斛400 mg/(kg·d)和二甲雙胍400 mg/(kg·d)，二甲雙胍組小鼠灌胃二甲雙胍400 mg/(kg·d)，正常組小鼠和模型組小鼠灌胃等體積的0.9%的氯化鈉溶液，各組小鼠均于每日中午12:00灌胃給藥，均給藥14周。

1.2.2 檢測方法 ①各組小鼠肝臟組織中固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（FAS） mRNA表達水平。小鼠取血后，過量麻醉處死，從各小鼠中取約100 mg肝臟組織，加入1 mL TRIzol進行勻漿，后添加0.2 mL三氯甲烷（CHCl3）以降低核糖核酸酶（RNase）活性并使蛋白變性，混合均勻后，4 ℃下，以12 000 r/min轉速離心低溫10 min，吸取水相層液體與異丙醇等體積混合均勻，在室內溫度自然放置10 min后，再離心10 min，溫度和轉速同上，吸棄上清溶液，用75%的乙醇沉淀洗滌2次；然后離心舍去上清，充分干燥使RNA沉淀，加入適量的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解樣品，使用超微量紫外分光光度計測量RNA樣品的濃度和純度。根據所測濃度和逆轉錄試劑盒說明書要求，將各組小鼠RNA樣品調為同一濃度。逆轉錄的具體程序為預變性溫度調至60 ℃，持續32 s；接著95 ℃持續5 s變性；將溫度調至95 ℃，持續2 min退火/延伸，變性和退火/延伸階段重復總共40次循環數。運用實時熒光定量PCR試劑盒測定各組樣品SREBP-1C、FAS基因的表達情況，GADPH為內參基因，各基因引物序列見表1。實時熒光定量PCR的具體擴增步驟為：得出樣品各基因表達的Ct值（每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數）后，運用2-ΔΔCt 法算出組織中各個目的mRNA的相對表達量。②WB實驗法測量各組小鼠肝臟組織中Tyk2、STAT3蛋白表達。取各小鼠肝臟組織100 mg后，加入500 μL細胞組織快速裂解液（RIPA），充分裂解，溫度4 ℃，以12 000 r/min轉速離心10 min，取上清液，運用二喹啉甲酸法（BCA）定量后，使用上樣緩沖液將各樣品蛋白含量調為一致，混勻后100 ℃煮沸變性。SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白并轉膜，使用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h。加入Tyk2、STAT3一抗或GAPDH內參蛋白一抗于4 ℃搖床內孵育過夜。次日使用TBST洗膜，加入二抗孵育2 h。TBST洗膜后進行顯影操作，并計算各目標蛋白灰度值大小，以GADPH蛋白為內參，統計各目標蛋白的相對表達量。

表1 引物序列

1.3 觀察指標 ①對比各組小鼠總體狀態，包括小鼠活躍程度、精神狀況等。②給藥14周后，小鼠禁食12 h，取各組小鼠尾靜脈血6 mL后采用斷頸方式處死，血樣分為兩份，一份采用血糖儀測定血糖水平，另一份血樣放置于室內溫度自然凝固，超速離心機3 000 r/min離心15 min，將樣品中血清分離開，使用全自動生化儀測定血清AST、ALT水平。③給藥14周后血脂與肝功能指標，血樣采集、血清制備及檢測方法同②，測定血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C水平。④采用RT-qPCR法測量各組小鼠肝臟組織中SREBP1c、FAS mRNA相對表達量。⑤采用WB實驗法檢測各組小鼠肝臟組織中Tyk2、STAT3蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法 運用SPSS 24.0統計軟件分析數據，計量資料以(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用重復測量方差分析。以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠總體狀態 模型組小鼠的體格相較于正常組更大，且更加活躍，但外表皮毛容易脫落，顏色暗淡，皮毛質感粗糙。石斛組、石斛聯合二甲雙胍組、二甲雙胍組小鼠則正常行動，動作敏捷，呈正常的精神狀況，外表平光滑明亮。

2.2 空腹血糖及血清AST、ALT水平 給藥14周后，與正常組比，模型組小鼠空腹血糖及血清AST、ALT水平均顯著升高；與模型組比，石斛組、二甲雙胍組、石斛+二甲雙胍組小鼠上述指標水平均逐漸降低，且石斛+二甲雙胍組顯著低于石斛組，石斛+二甲雙胍組小鼠血清AST顯著低于二甲雙胍組，二甲雙胍組小鼠血清ALT顯著低于石斛組，差異均有統計學意義（均P＜ 0.05），見表2。

表2 各組小鼠空腹血糖及血清AST、ALT水平比較(?±s)

表2 各組小鼠空腹血糖及血清AST、ALT水平比較(?±s)

注：與正常組比，*P ＜ 0.05；與模型組比，#P ＜ 0.05；與石斛組比，△P ＜ 0.05；與二甲雙胍組比，▲P ＜ 0.05。AST：天門冬氨酸氨基轉移酶； ALT：丙氨酸氨基轉移酶。

組別 只數空腹血糖(mmoL) AST(U/L) ALT(U/L)正常組 10 6.01±0.68 1.93±0.19 2.58±0.20模型組 10 9.04±0.99* 4.68±0.23* 6.02±0.47*石斛組 10 7.24±1.20*# 3.12±0.45*# 4.56±0.96*#二甲雙胍組 10 6.20±0.98# 2.76±0.47*# 3.15±0.34*#△石斛+二甲雙胍組 10 6.11±0.77#△ 1.99±0.15#△▲ 2.94±0.37*#△F值 12.004 79.136 49.289 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 血脂指標水平 給藥14周后，與正常組比，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均顯著升高，HDL-C水平均顯著降低；與模型組比，石斛組、二甲雙胍組、石斛+二甲雙胍組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均逐漸降低，HDL-C水平均逐漸升高；且石斛+二甲雙胍組血清HDL-C顯著高于石斛組，血清LDL-C水平顯著低于石斛組；二甲雙胍組血清LDL-C水平顯著低于石斛組，差異均有統計學意義（均P＜ 0.05），見表3。

表3 各組小鼠血脂指標水平比較(?±s,?mmol/L)

表3 各組小鼠血脂指標水平比較(?±s,?mmol/L)

注：與正常組比，*P ＜ 0.05；與模型組比，#P ＜ 0.05；與石斛組比，△P ＜ 0.05；與二甲雙胍組比，▲P ＜ 0.05。TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇。

組別 只數 TC TG HDL-C LDL-C正常組 10 0.86±0.18 0.74±0.15 4.96±0.43 2.68±0.22模型組 10 1.53±0.19* 1.33±0.12* 1.81±0.17* 6.24±0.56*石斛組 10 1.06±0.36# 0.91±0.34# 3.79±0.77# 4.81±0.84*#二甲雙胍組 10 1.00±0.14# 0.86±0.12# 4.33±1.18# 3.34±0.27*#△石斛+二甲雙胍組 10 0.86±0.16# 0.81±0.17# 4.65±0.94#△ 2.92±0.40#△F值 9.311 8.388 20.642 61.101 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.4 SREBP1c、FAS mRNA相對表達量 給藥14周后，與正常組比，模型組小鼠肝臟組織中SREBP1c、FAS mRNA相對表達量均顯著升高；與模型組比，石斛組、二甲雙胍組、石斛+二甲雙胍組上述指標均逐漸降低，且3組間兩兩比較，差異均有統計學意義（均P＜ 0.05），見表4。

表4 各組小鼠SREBP1c、FAS mRNA相對表達量比較(?±s)

表4 各組小鼠SREBP1c、FAS mRNA相對表達量比較(?±s)

注：與正常組比，*P ＜ 0.05；與模型組比，#P ＜ 0.05；與石斛組比，△P ＜ 0.05；與二甲雙胍組比，▲P ＜ 0.05。

FAS mRNA相對表達量正常組 10 1.06±0.05 1.06±0.05模型組 10 7.81±0.46* 5.16±0.32*石斛組 10 6.01±0.65*# 3.05±0.20*#二甲雙胍組 10 3.85±0.53*#△ 1.39±0.28*#△石斛+二甲雙胍組 10 3.12±0.25*#△▲ 1.17±0.11*#△▲F值 102.731 206.886 P值 ＜0.05 ＜0.05組別 只數 SREBP1c mRNA相對表達量

2.5 Tyk2、STAT3蛋白相對表達量 給藥14周后，與正常組比，模型組小鼠肝臟組織中Tyk2、STAT3蛋白相對表達量均顯著升高；與模型組比，石斛組、二甲雙胍組、石斛+二甲雙胍組Tyk2蛋白相對表達量呈逐漸降低趨勢，且3組間兩兩比較，差異均有統計學意義（均P＜ 0.05），石斛組、二甲雙胍組、石斛+二甲雙胍組小鼠肝臟組織中STAT3蛋白相對表達量均較模型組顯著降低，但3組間兩兩比較，差異均無統計學意義（均P＞ 0.05），見表5、圖1。

表5 各組小鼠Tyk2、STAT3蛋白相對表達量比較(?±s)

表5 各組小鼠Tyk2、STAT3蛋白相對表達量比較(?±s)

注：與正常組比，*P＜0.05；與模型組比，#P＜0.05；與石斛組比，△P＜0.05；與二甲雙胍組比，▲P＜0.05。Tyk2：酪氨酸激酶2；STAT3：轉錄信號轉導子與激活子3。

STAT3蛋白相對表達量組別 只數 Tyk2蛋白相對表達量正常組 10 0.16±0.01 0.24±0.02模型組 10 0.43±0.02* 0.48±0.10*石斛組 10 0.28±0.01*# 0.31±0.10*#二甲雙胍組 10 0.22±0.02*#△ 0.34±0.06*#石斛+二甲雙胍組 10 0.18±0.04*#△▲ 0.32±0.04*#F值 24.457 6.135 P值 ＜0.05 ＜0.05

圖1 WB檢測小鼠肝臟組織Tyk2、STAT3蛋白表達

3 討論

NAFLD除可直接導致失代償期肝硬化、肝細胞癌和移植肝復發外，還可影響其他慢性肝病的進展，并參與T2DM和動脈粥樣硬化的發病，嚴重威脅人類健康。二甲雙胍是治療糖尿病的首選藥物，其主要通過改善胰島素抵抗來達到降低血糖的目的，適用于肥胖的T2DM患者。相關研究表明，二甲雙胍除了能夠降低血糖以外，還具有調節血脂、改善脂代謝、降低體質量等作用，但用藥期間患者會產生腹瀉、厭食、惡心、金屬味等胃腸道不良反應[5]。

中醫認為，NAFLD屬于“瘀證”“肥氣”“痰濁”等范疇，主要是由于在飲食中未對辛辣肥甘厚味加以節制，最終導致體內生出痰濕，并且脾臟功能受到損害，最終痰濕蘊含其中，更兼以瘀血的運行不暢導致痰瘀互結，影響肝臟中脈絡的正常運行，最終引發脂肪肝[6]。鐵皮石斛具有益胃生津，滋陰清熱之功效，常用于熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目暗不明，筋骨痿軟等的治療[7]。本研究中，給藥14周后，與模型組相比，石斛組、二甲雙胍組、石斛+二甲雙胍組小鼠空腹血糖、血清LDL-C、TC、TG、AST、ALT水平均顯著降低，HDL-C水平均顯著升高，且石斛+二甲雙胍組空腹血糖、血清AST、ALT、LDL-C顯著低于石斛組，血清HDL-C高于石斛組；石斛+二甲雙胍組血清AST顯著低于二甲雙胍組，二甲雙胍組血清ALT、LDL-C水平顯著低于石斛組，提示鐵皮石斛聯合二甲雙胍可調節T2DM合并NAFLD小鼠糖脂代謝，改善小鼠肝臟功能。分析其原因可能為，鐵皮石斛中的總生物堿可激活并增強酰基輔酶A氧化酶1（ACOX1）、過氧化物酶體增殖激活受體α（PPARα）及脂肪組織三酰甘油水解酶（ATGL）的活性，從而實現對膽固醇調節元件結合蛋白1（SREBP1）表達的調控，以此來達到降血脂的目的；鐵皮石斛具有抑制腎上腺素引起的肝糖原分解和促進肝糖原合成的作用，從而可減少血糖的來源，降低血糖，同時鐵皮石斛中多糖能有效地抑制AST的升高，具有良好的護肝降酶和抗肝纖維化作用[8]。二甲雙胍具有改善胰島素抵抗的作用，使人長時間處于胃飽滿狀態而產生輕度厭食，從而達到降低血糖、減輕體質量的目的；二甲雙胍還可以改善脂肪的合成與代謝，同時對肝臟的炎癥和肝纖維化也有很好的改善作用[9]。

相關研究顯示，SREBP-1c為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mTORC1）下游因子，是肝臟脂肪合成過程中重要的轉錄調節因子，可通過調節其下游脂肪酸合成靶基因的表達，參與NAFLD的發生發展[10]；同時SREBP-1c在人的肝癌組織中表達較癌旁組織增高，且其表達程度與TNM分期、腫瘤體積、生存時間均呈現一定相關性。FAS是TG和脂肪酸代謝中的關鍵酶，因此推測在高糖刺激下高表達叉頭框蛋白O1（FoxO1）可能是通過FAS引起脂滴增多，而在哺乳動物骨骼肌肉中FoxO1抑制mTOR蛋白合成信號通路，參與蛋白質分解；同時FAS是以二聚體為主要存在形式的多功能酶，其能影響機體的能量代謝，還能催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸，從而導致NAFLD患者體內發生體脂沉積作用[11]。相關研究顯示，定心方Ⅲ號方可通過抑制Akt/mTOR/SREBP1c信號通路改善肝臟組織的脂質代謝過程，從而保護NAFLD小鼠肝臟功能[12]；也有相關研究顯示，鐵皮石斛中多糖和醇提取物可通過調控mTORC1/SREBP-1c信號通路信號轉導，抑制小鼠肝細胞脂質沉積，從而阻制NAFLD的發生發展[13]；此外，鐵皮石斛中的醇提取物還能顯著降低小鼠血清TG水平，提高機體總抗氧化能力，對機體糖脂代謝具有綜合改善作用。本研究中，給藥14周后，與模型組相比，石斛組、二甲雙胍組、石斛+二甲雙胍組小鼠肝臟組織中SREBP1c、FAS mRNA相對表達量均降低，且3組間兩兩比較，差異均有統計學意義，提示鐵皮石斛聯合二甲雙胍可抑制T2DM合并NAFLD小鼠體內合成脂肪酸的合成，從而抑制疾病發展，其作用機制可能與下調mTORCl/SREBP-lc通路中SREBP1c、FAS 基因表達相關。

Tyk2是蛋白酪氨酸激酶（JAk）譜系中重要的一員，其與某些內分泌激素具有密切聯系；STAT3則與信號的傳遞和轉錄的啟動有著直接關系，兩者均是JAK/STAT信號通路的核心成員。通過生化研究和基因靶向的小鼠研究發現，Tyk2參與機體多項免疫過程，Tyk2缺乏并不影響小鼠的生存，但會導致小鼠免疫功能低下，同時更易引發感染或腫瘤性疾病。相關研究證明，Tyk2對于乳腺癌細胞的生理活動具有抑制作用，具體表現為抑制癌細胞的生長能力和轉移能力[14]；同時Tyk2能促進棕色脂肪細胞的分化能力，對于缺少Tyk2的鼠群，其相較于普通鼠群更易發生肥胖，且隨著鼠齡的增加肥胖變得尤為明顯，合理進食會對Tyk2的表達含量起到一定控制，因此肥胖人群Tyk2基因表達普遍處于低于正常人群，而肥胖程度越嚴重，T2DM的發病概率越高。STAT3也是JAK/STAT通路中最具有代表性的信號傳遞子，其在脂肪細胞中大量表達，STAT3的激活對脂代謝具有不可忽略的調控功能。相關研究顯示，NAFLD小鼠模型存在下丘腦STAT3蛋白表達和激活的明顯下調，使用中藥對模型組大鼠進行降脂治療可明顯改善其NAFLD的發病情況，并可上調 STAT3的表達和組成性激活，提示STAT3參與NAFLD的形成過程[15]。朱冬梅[16]報道，根皮苷可直接調控肥胖小鼠棕色脂肪Tyk2/STAT3信號通路轉導，增強棕色脂肪的能量代謝，在一定程度上促進小鼠機體的能量消耗，調控血脂代謝，抑制肥胖進展，有利于抑制T2DM和NAFLD的發生。目前關于鐵皮石斛對于Tyk2/STAT3信號通路的調控作用尚未見報道。本研究結果顯示，給藥14周后，與模型組相比，石斛組、二甲雙胍組、石斛+二甲雙胍組小鼠肝臟組織中Tyk2蛋白相對表達量呈現逐漸降低趨勢，且3組間兩兩比較，差異均有統計學意義；而STAT3蛋白表達量均顯著降低，但3組間兩兩比較，差異均無統計學意義，提示鐵皮石斛聯合二甲雙胍可顯著抑制T2DM合并NAFLD小鼠肝臟組織Tyk2、STAT3蛋白表達，尤其是抑制Tyk2蛋白表達，從而改善T2DM合并NAFLD小鼠病理情況。

綜上，鐵皮石斛聯合二甲雙胍可顯著調節T2DM合并NAFLD小鼠糖脂代謝，改善小鼠肝臟功能，其作用機制可能與其調控mTORC1/SREBP、Tyk2/STAT3信號通路相關蛋白表達相關，但有關其具體作用機制，仍需進一步深入探討。