齊墩果酸對腦缺血再灌注大鼠的神經保護作用及機制研究

鄭霞薇，黃麗麗，謝國民

缺血性腦卒中是急性腦血液循環障礙導致腦組織缺血缺氧性壞死所致的臨床綜合征，具有高發病率、高致殘率、高病死率等特點，然而目前臨床上仍缺乏有效的治療藥物[1-4]。齊墩果酸是一種五環三萜類化合物，廣泛存在于各種植物中，如丁香、大蒜葉等，具有抗凋亡、抗氧化及抗腫瘤等作用[5-6]。Rong 等[7]發現齊墩果酸能改善腦缺血大鼠神經功能缺損癥狀，然而其潛在的機制尚不清楚。有文獻報道齊墩果酸可通過激活PI3K/Akt 信號通路抑制肝細胞凋亡，減輕大鼠肝再灌注損傷[8]。因此，本研究旨在探討齊墩果酸對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經保護作及其調控機制。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 試驗動物 選取健康清潔級成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠45 只，體質量250～280 g，飼養于室溫21～25℃，濕度50%的環境。本實驗嚴格遵守國家動物實驗相關指導方針。

1.2 實驗流程

1.2.1 分組 采用隨機數字表法將SD 大鼠分為假手術組，腦缺血再灌注組，齊墩果酸組，齊墩果酸+DMSO 組，齊墩果酸+LY294002（PI3K 抑制劑）組。

1.2.2 藥物干預 齊墩果酸組、齊墩果酸+DMSO組、齊墩果酸+LY294002 組大鼠于術前4 d 開始腹腔注射齊墩果酸（25 mg/kg），每天1 次；假手術組及腦缺血再灌注組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。齊墩果酸+LY294002 組和齊墩果酸+DMSO組大鼠分別于術前4d側腦室注射10μl10mmol/L LY294002 溶液（LY294002加入DMSO 中配制而成）或10μl DMSO 溶液1 次。

1.2.3 側腦室注射 大鼠麻醉后俯臥位固定于腦立體定位儀上，備皮消毒后頭部正中作1 cm 切口，清楚暴露前囟點，以前囪點為坐標原點，向右旁開1.4mm，向后1mm為注射點，顱骨鉆頭鉆取顱孔，在腦立體定位儀的引導下將微量注射器針頭垂直插入4.5mm，即達側腦室，以2μl/min的注射速度注射10μlLY294002 溶液或10μlDMSO溶液，后緩慢退出注射器，縫合皮膚。

1.2.4 模型制備 參照改良ZeaLonga線栓法制備腦缺血再灌注模型。SD 大鼠經戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后消毒頸部皮膚，作頸部正中縱行切口，仔細分離血管和神經。線栓從頸外動脈插入，經頸內動脈直至大腦中動脈起始處，實現大腦中動脈的梗阻。2 h 后重新麻醉，拔出線栓，實現再通。假手術組按上述方法分離組織及暴露神經和血管，插入線栓，但不阻斷大腦中動脈的血流。

1.2.5 神經功能損傷評分 術后24 h 采用Rogers神經功能評分標準（具體評分細則見表1）對各組大鼠進行神經功能缺損評分。為了控制實驗基線水平，若Rogers 評分為0、6 或7 分，以及出現蛛網膜下腔出血則不納入后續試驗。

表1 Rogers 神經功能評分標準

1.2.6 TUNEL 染色 術后24 h 對各組大鼠進行麻醉，先后予0.9%氯化鈉注射液、4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液經左心室灌流，迅速斷頭取腦，常規石蠟包埋并切片（厚度5μm）。切片脫蠟后，使用原位細胞凋亡TUNEL 試劑盒檢測凋亡細胞。正置熒光顯微鏡下觀察（×200 倍數）腦梗死周圍組織的凋亡情況，Image-ProPlus 圖像分析處理系統計數凋亡細胞數，凋亡細胞率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.7 Western Blot 檢測 采用Western Blot 檢測Bax、Bcl-2、p-Akt、Akt 蛋白水平。術后24 h 各組大鼠經戊巴比妥鈉（30 mg/kg）、0.9%氯化鈉注射液左心室灌流后斷頭取腦，冰上分離出腦梗死周圍腦組織，與裂解液按比例混合后，經勻漿、裂解、超聲提取組織蛋白。BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，根據濃度制備Western Blot 上樣品，分別進行SDSPAGE 電泳分離，后轉至PVDF 膜上，經5%脫脂奶封閉、一抗孵育、二抗孵育后，凝膠成像儀對PVDF膜進行掃描曝光，Imag Lab 軟件進行灰度分析。

1.3 統計方法 采用SPSS 20.0軟件統計進行分析，使用GraphPad Prism、Photoshop 進行繪圖。計量資料用均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 齊墩果酸對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經功能缺損的影響 假手術組大鼠未見神經功能缺損的癥狀。其他4 組大鼠術后24 h 神經功能缺損評分差異有統計學意義（F=3.605，P＜0.05），其中齊墩果酸組神經功能缺損評分低于腦缺血再灌注組（P＜0.05），齊墩果酸組與齊墩果酸+DMSO 組神經功能缺損評分差異無統計學意義（P＞0.05），齊墩果酸+LY294002 組神經功能缺損評分高于齊墩果酸組和齊墩果酸+DMSO 組（均P＜0.05）。見彩圖1。

圖1 齊墩果酸對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經功能缺損的影響

2.2 齊墩果酸對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響 5 組大鼠術后24 h時梗死側梗死灶周腦組織細胞凋亡率差異有統計學意義（F=22.611，P＜0.05），其中腦缺血再灌注組細胞凋亡率高于假手術組（P＜0.05），齊墩果酸組細胞凋亡率低于腦缺血再灌注組（P＜0.05），齊墩果酸組與齊墩果酸+DMSO組細胞凋亡差異無統計學意義（P＞0.05），齊墩果酸+LY294002 組細胞凋亡率均高于齊墩果酸組和齊墩果酸+DMSO 組（均P＜0.05）。見彩圖2。

圖2 齊墩果酸對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響

2.3 齊墩果酸對大鼠腦缺血再灌注損傷后Bax、Bcl-2 蛋白表達水平的影響 5 組大鼠術后24 h 梗死側梗死灶周腦組織Bax 蛋白和Bcl-2 蛋白表達量差異均有統計學意義（F=22.612、10.394，均P＜0.05）。其中腦缺血再灌注組Bax 蛋白表達量高于假手術組，Bcl-2 蛋白表達量低于假手術組（均P＜0.05）；齊墩果酸組Bax 蛋白表達量低于腦缺血再灌注組，Bcl-2 蛋白表達量高于腦缺血再灌注組（均P＜0.05）；齊墩果酸組與齊墩果酸+DMSO 組Bax、Bcl-2 蛋白表達量差異均無統計學意義（均P＞0.05）；齊墩果酸+LY294002 組Bax 蛋白表達量高于齊墩果酸組和齊墩果酸+DMSO 組，Bcl-2 蛋白表達量低于齊墩果酸組和齊墩果酸+DMSO 組（均P＜0.05）。見彩圖3。

圖3 齊墩果酸對大鼠腦缺血再灌注損傷后Bax、Bcl-2 蛋白表達水平的影響

2.4 齊墩果酸對大鼠腦缺血再灌注損傷后p-Akt/Akt 的影響 5 組大鼠術后24 h 梗死側梗死灶周腦組織p-Akt/Akt 差異有統計學意義（F=51.216，P＜0.05）。其中腦缺血再灌注組p-Akt/Akt 低于假手術組（P＜0.05），齊墩果酸組大鼠p-Akt/Akt 高于腦缺血再灌注組（P＜0.05），齊墩果酸組與齊墩果酸+DMSO 組p-Akt/Akt 差異無統計學意義（P＞0.05）；齊墩果酸+LY294002 組p-Akt/Akt 均低于齊墩果酸組和齊墩果酸+DMSO 組（均P＜0.05）。見彩圖4。

圖4 齊墩果酸對大鼠腦缺血再灌注損傷后p-Akt/Akt 的影響

3 討論

缺血性腦卒中所造成的腦損傷與眾多病理過程相關，包括谷氨酸興奮毒性、凋亡、鈣超載及活性氧生成等[9]。近年來，盡管許多藥物在動物實驗中表現出顯著的神經保護作用，但都未能通過嚴格的臨床隨機試驗驗證。本研究主要目的是加深對腦梗死發病機制的了解，并促進腦梗死臨床治療藥物的研發。

近年來，有文獻指出齊墩果酸是缺血性腦卒中潛在的神經保護藥物[10]。Rong 等[7]發現齊墩果酸能顯著延長急性腦缺血小鼠生存時間，改善神經功能。Caltana 等[11]研究發現齊墩果酸在大鼠局灶性腦缺氧模型中也發揮重要的神經保護作用。然而，齊墩果酸神經保護作用機制仍有待進一步研究。大量研究發現齊墩果酸在許多動脈模型中發揮抗凋亡作用，如肝缺血再灌注損傷、急性肺損傷及脊髓損傷等[12-14]。本研究發現齊墩果酸能顯著降低神經功能缺損評分，TUNEL染色結果表明齊墩果酸明顯減少腦缺血再灌注大鼠凋亡細胞，Western Blot 結果表明齊墩果酸明顯增加腦缺血再灌注大鼠Bcl-2 的表達、減少Bax 表達。由此可見，齊墩果酸對腦缺血再灌注大鼠的神經保護作用，可能與其抗細胞凋亡作用相關。

PI3K/Akt 是一種細胞生存通路，具有抗凋亡、減輕炎癥的作用[15]。有文獻報道齊墩果酸可通過激活PI3K/Akt 信號通路抑制肝再灌注損傷大鼠的肝細胞凋亡[8]。本研究通過Western Blot 法檢測腦缺血再灌注大鼠的p-Akt、Akt 的蛋白表達，結果表明腦缺血再灌注大鼠p-Akt/Akt 顯著下調，而給予齊墩果酸治療后p-Akt/Akt 顯著上調。而給予腦缺血再灌注大鼠齊墩果酸和PI3K 抑制劑LY294002 共同處理后，p-Akt/Akt顯著下調，且齊墩果酸對腦缺血再灌注大鼠的抗凋亡作用受到顯著的抑制。由此可見，齊墩果酸是通過調節PI3K/AKT 通路減少大鼠腦缺血/再灌注后的細胞凋亡。

綜上所述，齊墩果酸是通過調節PI3K/AKT 通路減少大鼠腦缺血再灌注后的細胞凋亡，從而發揮神經保護作用。本研究結果可為腦梗死的臨床治療提供新的治療藥物，且對緩解腦梗死患者的臨床癥狀，改善預后具有重要價值。