基于二代基因測序在免疫抑制合并重癥肺炎病原診斷及治療中的應(yīng)用

馬肖龍，高鋒，馮思涵

重癥肺炎（SP）是在一些心肺疾病的基礎(chǔ)上附加危險(xiǎn)因素共同作用導(dǎo)致的肺炎，臨床發(fā)生率較高[1]。有研究顯示約20%的社區(qū)獲得性肺炎患者存在免疫抑制，免疫抑制并急性低氧性呼吸衰竭患者的短期病死率約50%[2-3]。由于免疫抑制合并SP 患者自身免疫調(diào)節(jié)異常，易造成大范圍組織的應(yīng)激損傷，患者長期使用免疫抑制劑，導(dǎo)致其細(xì)胞體液免疫受到抑制，因此免疫抑制合并SP患者的病情往往可控性差，生存率低。病原的早期鑒別決定了治療方案的精準(zhǔn)度[4]。二代基因測序（NGS）高通量基因測序是一種快速、精準(zhǔn)及低成本的基因檢測新方法，可快速、精準(zhǔn)地診療急危重癥感染，能對多個(gè)基因和未知序列進(jìn)行同步測序[5-6]。本研究以免疫抑制合并SP 患者為研究對象，基于肺泡罐洗液病原感染NGS 指導(dǎo)抗生素使用，探討NGS 在免疫抑制合并SP 中的應(yīng)用價(jià)值。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2020 年1月至2021 年5 月在浙江省嘉興市第一醫(yī)院就診的60 例免疫抑制合并SP 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合免疫抑制合并SP診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）未使用其他方案進(jìn)行治療；（3）對本研究方案知情，且自愿參與并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）治療期間出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)及異常表現(xiàn)；（2）有嚴(yán)重精神疾病；（3）支氣管鏡檢查禁忌者。按治療方法不同分為觀察組和對照組，各30 例，對照組男23 例，女7 例；平均年齡（55.3±10.2）歲；平均入院時(shí)間（16.12±5.84）d；合并基礎(chǔ)疾病：關(guān)節(jié)病5例，淋巴瘤2 例，抗中性粒細(xì)胞漿抗體（ANCA）相關(guān)性血管炎2 例，糖尿病8例，結(jié)締組織病2例，呼吸系統(tǒng)疾病5例，癌癥4 例，心腦血管疾病1 例，其他1 例。觀察組男21 例，女9 例；平均年齡（54.7±9.7）歲；平均入院時(shí)間（15.51±6.23）d；合并基礎(chǔ)疾病：關(guān)節(jié)病6 例，淋巴瘤3 例，ANCA相關(guān)性血管炎2 例，糖尿病7 例，結(jié)締組織病4 例，呼吸系統(tǒng)疾病3 例，癌癥2 例，心腦血管疾病2 例，其他1 例。兩組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) SP診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照第七版《內(nèi)科學(xué)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即符合以下l條主要標(biāo)準(zhǔn)或3 條次要標(biāo)準(zhǔn)者為SP[7]。主要標(biāo)準(zhǔn)：（1）需要有創(chuàng)機(jī)械通氣；（2）感染性休克需要血管收縮劑治療。次要標(biāo)準(zhǔn)：（1）呼吸頻率≥30 次/min；（2）氧合指數(shù)≤250 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）；（3）多肺葉浸潤；（4）意識(shí)障礙或定向障礙；（5）血尿素氮≥20 mg/dl；（6）低血壓，收縮壓＜90 mmHg；（7）白細(xì)胞（WBC）減少（＜4.0×109/L）；（8）血小板減少（＜10.0×109/L）；（9）核心體溫＜36 ℃[6]。免疫抑制診斷標(biāo)準(zhǔn)：血液系統(tǒng)腫瘤、實(shí)體惡性腫瘤、腫瘤化療、實(shí)體器官移植及人類免疫缺陷病毒（HIV）感染，長期口服潑尼松或大劑量靜脈使用糖皮質(zhì)激素治療≥2 周，長期接受免疫抑制劑治療。

1.3 方法 對照組病原鑒定采用VITEK MS 質(zhì)譜儀（法國梅里埃）進(jìn)行細(xì)菌鑒定，藥敏根據(jù)菌種陰性菌和陽性菌分別采用梅里埃全自動(dòng)分析儀VITEK 2 Compact 儀器相對應(yīng)的GN-AST 卡和GP-AST 卡檢測最低抑菌濃度（MIC值）。觀察組采用NGS 檢測肺泡灌洗液的感染病原，同時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)測定結(jié)果選擇敏感抗生素進(jìn)行治療。對照組早期采用經(jīng)驗(yàn)性用藥給予廣譜抗菌藥物治療，根據(jù)上述病原學(xué)檢測、藥敏試驗(yàn)及初步療效調(diào)整用藥方案，同步調(diào)整免疫抑制劑用量，接受抗菌藥物治療的同時(shí)保持營養(yǎng)支持，糾正低蛋白血癥。觀察組在對照組治療方案的基礎(chǔ)上，根據(jù)NGS 測定鑒別報(bào)告與患者病程進(jìn)展調(diào)整抗菌方案。

1.4 觀察指標(biāo) 兩組在治療第1、3、7天檢查血常規(guī)[WBC、淋巴細(xì)胞（LYM）水平]、血?dú)夥治鯷氧分壓（PaO2）、二氧化碳分壓（PCO2）]、血清C 反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）、血鉀、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、肌酐（CR）水平及胸部CT 或X 線片。療效判定：根據(jù)患者胸部CT 判定是否有效，有效為患者下呼吸道感染癥狀有不同程度的消退和改善，統(tǒng)計(jì)患者生存時(shí)間，繪制30 d 生存曲線，計(jì)算生存率[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組病原檢測結(jié)果 NGS 病原檢查結(jié)果與傳統(tǒng)痰培養(yǎng)病原檢測存在差異，NGS病原檢查陽性檢出率為83.3%，傳統(tǒng)痰培養(yǎng)病原檢測陽性檢出率為40.0%；其中傳統(tǒng)痰培養(yǎng)陰性14 例，但NGS 結(jié)果陽性，見表1。病原菌分別為椰氏肺孢子菌、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、軍團(tuán)菌、屎腸球菌、白色念珠菌、嗜麥芽窄食單胞菌、副流感嗜血桿菌、緩癥鏈球菌、齲齒放線菌、銅綠假單胞菌及溶血性葡萄球菌。

表1 觀察組病原學(xué)檢測結(jié)果 例

2.2 兩組炎癥細(xì)胞水平比較 第7 天時(shí)，觀察組WBC水平低于對照組，LYM水平高于對照組（t=2.405、2.689，均P＜0.05），見表2。

表2 兩組炎癥細(xì)胞水平比較 109/L

2.3 兩組血?dú)夥治鲋笜?biāo)比較 隨著治療時(shí)間的延長，兩組PaO2均升高，第7天時(shí)，觀察組PaO2高于對照組（t=3.512，P＜0.05）；兩組PaCO2水平先升高后降低，第7 天時(shí)，觀察組PaCO2高于對照組（t=2.977，P＜0.05）。見表3。

表3 兩組血?dú)夥治鲋笜?biāo)比較 mmHg

2.4 兩組炎性因子表達(dá)水平比較 兩組第1 天各炎癥因子表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），觀察組第3天及第7 天CRP、PCT、ALT、AST、CR表達(dá)水平均低于對照組（均P＜0.05）。見表4。

2.5 生存曲線分析 觀察組30 d 生存率為83.33%，高于對照組的60.00%（=4.02，P＜0.05），見彩圖1。

圖1 生存曲線分析

3 討論

SP 是病死率較高的一種呼吸道疾病，免疫抑制并發(fā)SP患者病原學(xué)尤為復(fù)雜，其病死率僅次于惡性腫瘤和心腦血管疾病[8]。免疫抑制患者的免疫反應(yīng)長期處于抑制狀態(tài)，極易引起感染發(fā)生，常見的感染性疾病就是肺部感染，炎癥反應(yīng)失控和免疫失衡是重癥感染的一大核心問題[9]。目前主流治療方式是大量使用抗生素進(jìn)行抗菌治療，現(xiàn)行抗生素的協(xié)同原則易導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)，無法及時(shí)且有效地控制感染，導(dǎo)致病情惡化，因此了解病原菌的分布特征及耐藥情況是選擇、優(yōu)化抗菌用藥精準(zhǔn)度的前提[10]。臨床上應(yīng)用較廣泛的肺炎檢測方法主要有痰細(xì)菌培養(yǎng)、血培養(yǎng)、血肺炎支原體、咽試子和肺泡灌洗液檢測。纖維支氣管鏡通過留取肺泡灌洗液進(jìn)行病原篩查，為疾病的診斷提供依據(jù)，其與痰培養(yǎng)、咽試子相比，后者所取痰液標(biāo)本更多來源于上呼吸道，容易遭到上氣道定植菌的污染，從而可能得出與臨床表現(xiàn)不相符的結(jié)果，不能達(dá)到真正指導(dǎo)臨床用藥的目的。因此臨床上針對肺炎病原的篩查，需提高病原檢出率，為臨床合理使用抗生素提供依據(jù)[11-12]。

NGS 技術(shù)可通過提取感染部位標(biāo)本的病原微生物核酸，采用常規(guī)文庫構(gòu)建流程，對標(biāo)本中的核酸進(jìn)行測序并計(jì)算出序列數(shù)，序列數(shù)與標(biāo)本的病原體載量負(fù)荷、核酸提取量呈正相關(guān)的關(guān)系，在短時(shí)間內(nèi)檢測包括細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、分枝桿菌、支原體和衣原體等在內(nèi)的多種病原微生物[13]。NGS 技術(shù)具有檢測速度快、準(zhǔn)確率高、成本低、覆蓋面廣以及產(chǎn)出巨大等特點(diǎn)，且采用宏基因組高通量技術(shù)檢測病原微生物的靈敏度和特異度均優(yōu)于傳統(tǒng)的方法，并且受抗菌藥物的影響較小，細(xì)菌學(xué)與分子生物學(xué)結(jié)合的檢查技術(shù)是醫(yī)學(xué)上重要的進(jìn)展之一，為臨床上診斷疑難性感染類疾病帶來了革命性的突破[14]。

本研究通過探討NGS 技術(shù)在免疫抑制合并SP診斷中的應(yīng)用價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組的NGS 病原檢查結(jié)果與傳統(tǒng)痰培養(yǎng)病原檢測存在差異，傳統(tǒng)痰培養(yǎng)病原鑒定為陰性的情況下，NGS 病原檢查為陽性，NGS 病原檢測陽性率為83.3%，傳統(tǒng)痰培養(yǎng)病原檢測陽性率為40.0%。本研究對傳統(tǒng)痰培養(yǎng)病原檢測的假陰性病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)未檢出的病原菌分別為椰氏肺孢子菌、嗜麥芽窄食單胞菌、副流感嗜血桿菌、緩癥鏈球菌、齲齒放線菌、銅綠假單胞菌及溶血性葡萄球菌等。此可見，傳統(tǒng)痰培養(yǎng)病原檢測方法對病原菌的檢出具有明顯的局限性，臨床鑒別需要更為精準(zhǔn)的方法對病原菌進(jìn)行鑒別，并指導(dǎo)臨床改進(jìn)治療方案。在NGS 病原檢查結(jié)果的指導(dǎo)下，觀察組在治療過程中，炎癥細(xì)胞因子、炎性因子水平及血?dú)夥治龅戎笜?biāo)均優(yōu)于對照組，且30d生存率高于對照組（均＜0.05）。

綜上所述，根據(jù)NGS技術(shù)病原檢查結(jié)果指導(dǎo)調(diào)整優(yōu)化抗生素的治療方案可提高免疫抑制合并SP患者的治療效果，降低病死率，NGS 技術(shù)對于感染性疾病病原早期診斷及治療的有效工具，對指導(dǎo)臨床治療具有重要的價(jià)值。