原花青素B2對PM2.5急性暴露致大鼠心臟毒性的保護作用

任敬一，沈 強，陳君蘭，陳夢圓，呂帥帥，馬玉霞

(河北醫科大學公共衛生學院，河北省環境與人群健康重點實驗室，河北 石家莊 050017)

近年來，大氣污染對居民健康和社會經濟的發展造成了巨大影響，尤以PM2.5對人體的損傷較為嚴重[1]，PM2.5是構成可吸入顆粒物的主要成分，PM2.5會把有毒有害物質帶入肺泡，部分有毒有害物質會通過肺泡毛細血管屏障入血，進而損傷身體各個部位[2]。大量流行病學研究證實PM2.5與心血管疾病的發病率和死亡率密切相關[3-4]，Miller等[5]研究發現PM2.5暴露水平每增加10 μg/m3，心血管事件風險增加24%、心血管疾病死亡風險增加76%。研究表明，營養干預可以明顯減輕因PM2.5暴露引起的肺部和心血管的炎癥和氧化損傷[6-8]。原花青素是一類多酚化合物，具有抗炎、抗氧化和清除機體產生的自由基等多種作用。原花青素B2(procyanidin B2,PCB2)是原花青素的一種形式，已有研究顯示PCB2可以減輕百草枯引起的肺部炎癥[9]，對黃曲霉毒素引起的肝損傷也具有保護作用[10]，本研究旨在探討PCB2 對大氣PM2.5引起的心臟炎癥和氧化應激的保護作用，以期為預防PM2.5引起的損傷及PCB2的臨床應用提供實驗參考依據。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 KC-1000型大流量采樣器購自上海隆拓儀器設備有限公司，KQ-500B型超聲震蕩儀由昆山市超聲儀器有限公司提供，Free Zone 2.5 Plus型真空冷凍干燥儀為LABCONCO公司產品，Multiskan FC型酶標儀為Thermo Scientific公司產品，TP-114型紫外可見分光光度計為Metash公司產品。PCB2(HPLC≥98%)為南京源植生物科技有限公司產品，白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)和白細胞介素18(interleukin-18,IL-18)的酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA )檢測試劑盒為上海酶聯生物科技有限公司產品，產品貨號分別為ml037361、ml02828和ml002816，總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，貨號分別為A005-1-2、A003-1-2和A001-3-2。

1.2PM2.5的采集及處理 2017年11月-2018年3月使用大氣采樣器在石家莊市長安區某高校樓頂(高約10 m左右，周圍沒有明顯的工業污染源)進行采樣，PM2.5會隨氣流富集到采樣濾膜上。小心將采樣后的濾膜裁剪成小塊浸沒于三蒸水中，經超聲震蕩，洗脫顆粒。紗布過濾，收集濾液，冷凍真空干燥，-80 ℃保存待用。染毒前，用無菌生理鹽水配制成相應濃度的懸濁液，超聲震蕩混勻。

1.3實驗動物分組及處理 體重150～180 g的SPF級雄性SD大鼠共24只，購買于河北醫科大學實驗動物中心，許可證號為：SCXK (冀) 2018-004。養于SPF級動物房內，溫度(21±1)℃，相對濕度40%～60%。采用隨機數字表法隨機分為3組，每組8只，分別為生理鹽水對照組、PM2.5組和PCB2組。PCB2組給予PCB2灌胃，灌胃劑量為40 mg/kg，以體重計，生理鹽水對照組和PM2.5組給予三蒸水灌胃，均持續21 d。在第8，10，12天，對PM2.5組和PCB2組大鼠進行氣管滴注細顆粒物懸濁液(滴注劑量為10 mg/kg)，對生理鹽水對照組氣管滴注生理鹽水。最后一次灌胃24 h后，使用10%烏拉坦(10 mg/kg)麻醉，取心臟于-80℃冰箱凍存，備用。

1.4心臟組織病理學觀察 取大鼠心臟，使用生理鹽水沖洗，取心臟橫切截面組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，將蠟塊固定于切片機上，調整厚度為6 μm，切片完成后進行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，在顯微鏡下觀察心臟的病理學改變及炎性細胞的聚集情況。

1.5指標測定 心臟組織稱重，組織勻漿3 000 r/min離心15 min，離心半徑為7 cm，取上清。嚴格按照測試盒說明進行各項指標測定，包括炎性損傷指標(IL-1β、IL-6、IL-18)和氧化應激指標(MDA、SOD、GSH-Px)。

1.6統計學方法 應用SPSS 21.0 軟件進行統計學數據分析。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1大鼠一般體征的變化 實驗過程中未見大鼠死亡，生理鹽水對照組、PM2.5組和PCB2組均正常生長。與生理鹽水對照組相比，氣管滴注PM2.5后，大鼠出現明顯的活動和攝食減少，呼吸出現哮鳴音，精神萎靡，皮毛光澤度下降，對外界刺激反應緩慢。

2.2大鼠心肌細胞組織學變化 低倍鏡下，生理鹽水對照組心肌組織細胞排列整齊，肌纖維走行一致，細胞核清晰可見；PM2.5組心肌細胞排列不整齊，心肌間可見部分毛細血管擴張充血，血管周圍淋巴細胞浸潤；PCB2組與PM2.5組比較，心肌細胞排列較整齊，未見毛細血管充血及明顯炎癥細胞浸潤。在高倍鏡下，對心臟組織心肌纖維排列變化和炎性浸潤的觀察更明顯，PCB2組逆轉損傷的趨勢與低倍鏡觀察結果相近。見圖1。

圖1 大鼠心臟組織HE染色病理學圖片

2.3PCB2對PM2.5所致大鼠炎癥損傷的保護作用 與生理鹽水對照組相比，PM2.5組的IL-1β、IL-6和IL-18的含量均顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)。與PM2.5組相比，PCB2組IL-1β、IL18均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 PM2.5致大鼠心臟炎性反應及原花青素B2的保護作用Table 1 Effects of PCB2 on PM2.5 induced inflammatory response of heart tissues in rats

2.4原花青素B2對PM2.5所致大鼠心臟氧化應激的保護作用 與生理鹽水對照組相比，PM2.5組大鼠心臟中SOD和GXH-Px的含量降低，MDA含量明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與PM2.5組相比，PCB2組SOD和GXH-Px含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 PM2.5致大鼠心臟氧化應激的影響及PCB2的保護作用 Table 2 Effects of PCB2 on PM2.5 induced oxidative stress of heart tissues in rats

3 討 論

大氣顆粒物是大氣中各種固態和液態顆粒狀物質的總稱，成分復雜，直徑越小危害越大，PM2.5作為環境中空氣動力學直徑較小的顆粒物會嚴重損傷人體的各個器官。PM2.5不僅會對呼吸系統造成影響[11]，而且也是誘發心血管疾病的重要因素[12-14]。流行病學研究表明，長期PM2.5暴露可明顯增加缺血性心臟病、心律失常、心力衰竭和心臟驟停患者的死亡風險[3,15]，對心臟有毒性作用。有研究顯示，PM2.5暴露引起的心血管疾病是由內皮細胞損傷和全身炎癥介導所致[16-17]。當機體受到PM2.5攜帶的有害物質刺激后，自身發生炎癥反應和氧化應激反應，氧化應激會使血管平滑肌細胞生長和遷移，血管壁增厚，促進內皮細胞凋亡，損傷血管。血管內皮損傷會導致血管舒縮功能障礙，造成心肌缺血等心臟病變。同樣血管損傷也可致脂質沉著和血栓形成，引起冠狀動脈粥樣硬化等病癥，嚴重可造成心力衰竭危及生命。

原花青素是植物中廣泛存在的一類多酚化合物的總稱，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等多種藥理作用。研究表明原花青素可以下調促炎因子水平，降低促炎介質的活性，通過抑制MAPK信號通路抑制炎性損傷[18]。Rong等[19]研究顯示原花青素可以減少一氧化氮的產生和誘導型一氧化氮合酶的表達，對內皮有保護作用，通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶依賴的機制降低氧化應激，對動脈粥樣硬化具有一定的改善作用。PCB2是原花青素中功能活性最強的部分，然而目前為止，關于PCB2在PM2.5所致心臟損傷中的保護作用未見報道。

PM2.5可導致心臟損傷，氧化應激和炎癥反應被認為是其發生的中心機制。本研究結果顯示，PM2.5急性暴露后，心肌組織發生了炎性改變，心肌中毛細血管擴張充血，淋巴細胞浸潤；對炎癥因子檢測發現，PM2.5誘導了IL-1β、IL-6和IL-18的升高，說明PM2.5介導了心臟的炎性反應，而PCB2可以降低心肌中因PM2.5暴露導致的IL-1β和IL-18的表達。提示PCB2可以改善心臟的炎性反應，對PM2.5暴露所致的心臟損害有一定保護作用。研究表明，PM2.5暴露還可以導致機體產生氧化損傷，機體在遭受氧化損傷時，抗氧化酶發揮著重要的作用。SOD可以抑制活性氧的生成，GSH-Px可以有效將機體中產生的有害過氧化物還原為無害的羥基化合物，從而保護細胞膜的結構和功能不受過氧化物的干擾和損害。本研究的氧化損傷指標顯示，PM2.5暴露導致SOD、GSH-Px顯著下降，MDA顯著升高，PCB2干預可增加SOD、GSH-Px的表達，減少MDA的含量。以上結果均提示，PM2.5誘發了心肌細胞的氧化損傷，而PCB2干預明顯降低了這種影響，提示PCB2可以調節機體氧化和抗氧化之間的平衡，改善PM2.5暴露導致的心肌氧化損傷，從而對心肌損害起到保護作用。

如何預防PM2.5對人體健康的損害一直是公共衛生工作者重要的研究課題。原花青素是植物化學物的一種，在植物中分布廣泛，以葡萄籽中含量最高，我國產量豐富。低聚原花青素作為天然的抗氧化劑在國際上被廣泛使用。本研究從植物化學物的角度出發，探討其對大氣污染所致心臟損害的保護作用和機制，為從膳食預防慢性疾病的發生提供了思路。但本研究中，對原花青素發揮作用的機制研究還不夠深入，且對PCB2的起效劑量也沒有涉及，人群研究的數據還很缺乏，因此，針對原花青素對心臟損傷的保護作用尚需要進一步研究。