轉(zhuǎn)化生長因子-β亞型在慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者中的表達(dá)研究*

江 山，袁 競，秦 超，戴 曦

1.都江堰市人民醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科，四川 成都 611830；2.瀘州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種危害人類健康的慢性氣道性疾病，此疾病重要特點(diǎn)為進(jìn)行性加重和不可逆地呼氣氣流受限。此疾病發(fā)病率高，預(yù)測未來數(shù)十年里此疾病的發(fā)病率及死亡率仍然會(huì)持續(xù)增加，它可以使患者生活質(zhì)量出現(xiàn)嚴(yán)重下降、勞動(dòng)能力缺失［1］。有害刺激物吸入導(dǎo)致氣道內(nèi)的多種細(xì)胞功能失調(diào)，釋放炎癥介質(zhì)，趨化炎癥細(xì)胞，使氣道黏液分泌過度、細(xì)胞外基質(zhì)病理性沉積，從而導(dǎo)致慢性氣道炎癥引發(fā)氣道重塑以及管腔狹窄。黏液高分泌與氣道重塑這兩個(gè)原因是導(dǎo)致慢阻肺發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病理特征，而肺泡巨噬細(xì)胞（AM）和中性粒細(xì)胞則是導(dǎo)致COPD 炎癥的最重要兩大類炎性細(xì)胞。目前國內(nèi)關(guān)于AM 在COPD 發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制研究尚不完善，發(fā)生急性加重的機(jī)制亦不完全清楚。目前有部分研究發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路與氣道重塑關(guān)系密切，而其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1 已被大家確認(rèn)為一種強(qiáng)致纖劑，其表達(dá)水平與纖維化疾病的嚴(yán)重程度和死亡率明顯正相關(guān)［2-3］。然而在人體中TGF-β 與COPD 關(guān)系的研究尚不明確，而TGF-β2 與成纖維細(xì)胞的關(guān)系目前仍然尚存在爭議。本研究旨在探討TGF-β1/β2/β3在COPD 發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮的作用，進(jìn)一步研究三組轉(zhuǎn)化因子與COPD 急性加重期關(guān)系及相關(guān)的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

按照2016GOLD 診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取2019 年1 月—2021 年12 月西南醫(yī)科大學(xué)附屬就診的慢阻肺急性加重期病患14例作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，門診或者住院治療的COPD 穩(wěn)定期病患15 例，正常志愿者8 例，所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象均排除外支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張、糖尿病、高血壓、肺癌等合并癥。慢阻肺急性加重期組在行誘導(dǎo)痰檢查前4 周內(nèi)均未給予任何方式的激素治療。1%二硫蘇糖醇（DTT，Merk公司）；Human TGF-β1/β2/β3 ELISA 試劑盒（誠林生物公司）；兔抗人Smad2/3抗體、熒光標(biāo)記人抗兔IgG 抗體（Santa Cruz）；超聲霧化器；激光共聚焦顯微鏡；酶標(biāo)儀；MASSON 復(fù)合染色液、亮綠染色液等。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)方法

生理鹽水充分漱口后，分別用3%、4%、5%濃度梯度的NaCL 溶液進(jìn)行超聲霧化，5 分鐘/次，總霧化的時(shí)間不大于30分鐘，有咳痰時(shí)再次用生理鹽水漱口，繼而指導(dǎo)患者深咳，將深部的痰液收集至無菌痰杯內(nèi)密封保存，每份痰液標(biāo)本量大于等于2 mL。同時(shí)進(jìn)行電子支氣管鏡檢查并采集研究對(duì)象氣道黏膜上皮活檢標(biāo)本6 份，其中三份立即予以甲醛固定保存，另外三份放至錫箔紙4 ℃保存，當(dāng)日提取蛋白。標(biāo)本處理，挑取痰液標(biāo)本樣品進(jìn)行涂片染色并在顯微鏡下觀察，如若顯微鏡下每低倍鏡白細(xì)胞數(shù)大于等于25 個(gè)，或白細(xì)胞在10～25 個(gè)/Lp 并且上皮細(xì)胞數(shù)目小于10個(gè)，研究者則判定其為標(biāo)準(zhǔn)的合格的標(biāo)本樣品。挑取沒有唾液附著的痰液栓，加入0.1%二硫蘇糖醇（DTT）進(jìn)行充分溶解后，加入適量的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）進(jìn)行稀釋后離心。（1）收集上清液，采取ELISA 法檢測其中TGF-β1/β2/β3 的濃度。（2）沉淀的細(xì)胞成分分別以0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色并在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板下統(tǒng)計(jì)成活細(xì)胞率及細(xì)胞總數(shù)，并行瑞氏染色后行細(xì)胞分類并進(jìn)行計(jì)數(shù)，HE 染色并鑒定AM并調(diào)整其濃度，將懸液于37 ℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)2 h，取出細(xì)胞爬片，采用免疫熒光法檢測AM 中Smad2/3。（3）氣道黏膜活檢組織以石蠟切片采取常規(guī)方式脫蠟后，先后以MASSON 復(fù)合染色液、亮綠染色液染色5 min，給予常規(guī)的脫水，透明，然后進(jìn)行封片處理，進(jìn)而在鏡下觀察氣道上皮組織膠原纖維增生情況。（4）錫箔紙保存氣道粘膜活檢組織，提取總蛋白并測定蛋白濃度，配制SDSPAGE 凝膠，按步驟完成電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗溫育、洗膜、顯影、測量灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

COPD 急性加重期組的平均年齡為（66.79±6.34）歲，COPD 穩(wěn)定期組為（64.73±5.99）歲，正常對(duì)照組的平均年齡為（χ2=1.975，61.25±6.73）歲，所有三組實(shí)驗(yàn)對(duì)象的年齡，差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）；三組的男女比分別為7/7、8/7、4/4，構(gòu)成比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.667，P＞0.05）。三組的FEV1%預(yù)計(jì)值明顯不同，分別為48.88±7.98、59.11±6.98 和95.25±5.75，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=110.708，P＜0.05）。

2.2 誘導(dǎo)痰炎細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

慢阻肺急性加重期組誘導(dǎo)痰中炎癥細(xì)胞數(shù)最多并且以中性粒細(xì)胞為主，慢阻肺穩(wěn)定期組高于對(duì)照組誘導(dǎo)痰的炎細(xì)胞總數(shù)。慢阻肺患者不同病理階段誘導(dǎo)痰中AM 數(shù)目明顯有較大的差異，慢阻肺急性加重期組AM 計(jì)數(shù)最高，見表1、表2，圖1。

圖1 （A）誘導(dǎo)痰中炎細(xì)胞及AM計(jì)數(shù)，（B）誘導(dǎo)痰中炎細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

表1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象誘導(dǎo)痰炎細(xì)胞總數(shù)、分類計(jì)數(shù)

2.3 誘導(dǎo)痰TGF-β亞型表達(dá)水平及巨噬細(xì)胞中Smad2/3熒光強(qiáng)度

分別檢測誘導(dǎo)痰上清液中TGF-β1/β2/β3 的含量并進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，慢阻肺患者上述三個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，并且不同病程時(shí)期誘導(dǎo)痰中TGF-β1/β2/β3表達(dá)水平不同，慢阻肺急性加重期組中含量高于慢阻肺穩(wěn)定期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2，圖2A。慢阻肺患者不同病理階段誘導(dǎo)痰中Smad2/3 表達(dá)水平有明顯且較大的差異，慢阻肺急性加重期組巨噬細(xì)胞中Smad2/3 熒光強(qiáng)度最高，慢阻肺穩(wěn)定期組巨噬細(xì)胞Smad2/3 熒光強(qiáng)度亦高于對(duì)照組，見表2，圖2B、C。

圖2 （A）誘導(dǎo)痰中TGF-β1/β2/β3的表達(dá)水平，（B、C）AM中Smad2/3表達(dá)強(qiáng)度檢測

表2 各組誘導(dǎo)痰中TGF-β表達(dá)水平以及Smad2/3熒光強(qiáng)度

2.4 TGF-β 亞型與慢阻肺患者肺功能以及AM 數(shù)目和Smad2/3的相關(guān)性分析

根據(jù)慢阻肺患者總體相關(guān)性分析，TGF-β1/β2 在患者誘導(dǎo)痰中的表達(dá)水平與患者肺功能顯著負(fù)相關(guān)，與痰中AM 數(shù)目和Smad2/3 熒光強(qiáng)度之間均呈顯著正相關(guān)，但TGF-β3與肺功能、AM數(shù)目均沒有相關(guān)性，見圖3。

圖3 TGF-β1/β2/β3表達(dá)水平與患者肺功能巨噬細(xì)胞數(shù)目和Smad2/3的相關(guān)性分析

3 討論

炎癥細(xì)胞機(jī)制在目前的研究中認(rèn)為其是COPD 的重要病生機(jī)制之一［4-5］。本實(shí)驗(yàn)選擇主要來自周邊氣道小分支的誘導(dǎo)痰作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其細(xì)胞及生化成分更加集中。細(xì)菌、病毒包括支原體衣原體均導(dǎo)致COPD 的急性加重，細(xì)菌、病毒等病原體本身并不直接導(dǎo)致TGF-β的改變，而是會(huì)通過炎癥細(xì)胞經(jīng)過一系列通路來影響TGF-β 的表達(dá)水平。與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，中性粒細(xì)胞在慢阻肺急性加重期患者和COPD 穩(wěn)定患者中都是最為重要的炎癥細(xì)胞，與Barnes［6］的研究結(jié)果類似，中性粒細(xì)胞在急性加重期中持續(xù)穩(wěn)定的存在，而且在穩(wěn)定期氣道炎癥中仍舊持續(xù)穩(wěn)定的存在。誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞數(shù)目可預(yù)測COPD 的嚴(yán)重程度。中性粒細(xì)胞是IL-8的主要來源，具有通過其合成并釋放絲氨酸蛋白酶和氧化因子誘導(dǎo)組織損傷的能力，氣道中性粒細(xì)胞數(shù)量的增加與氣道氣流限制程度密切有關(guān)［7］。同時(shí)研究者發(fā)現(xiàn)COPD 急性加重期組嗜酸性粒細(xì)胞比率低于穩(wěn)定期組，并發(fā)現(xiàn)對(duì)照組及COPD 穩(wěn)定期組嗜酸性粒細(xì)胞率均不低于2%，與Hall［8］報(bào)道的COPD 加重期患者痰中的嗜酸性粒細(xì)胞明顯增加，吸入激素后痰中的嗜酸性粒細(xì)胞比例降低的結(jié)果存在不一致。

AM 定位于肺泡壁，同時(shí)具有抗炎以及促炎的雙向效應(yīng)，被認(rèn)為是另一種主要的氣道炎癥細(xì)胞，多個(gè)實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為AM 導(dǎo)致了氣道重塑和肺功能損傷，其數(shù)量與肺實(shí)質(zhì)的損害嚴(yán)重程度正性相關(guān)。人體中的巨噬細(xì)胞均可被激活并釋放大量的炎癥介質(zhì)、酶和細(xì)胞因子，包括IL-8和白三烯，TNF-α、NF-κB 等，過往的實(shí)驗(yàn)及臨床研究認(rèn)為AM通過炎癥介質(zhì)的相互作用可以導(dǎo)致氣道杯狀細(xì)胞增殖和膠原纖維增生，進(jìn)而導(dǎo)致黏液高分泌與氣道重塑；另一方面，AM 能分泌中性粒細(xì)胞趨化因子，在慢阻肺中促進(jìn)毛細(xì)支氣管慢性炎癥，分泌彈性蛋白酶破壞蛋白酶抗性蛋白酶系統(tǒng)的平衡。而上述炎癥效應(yīng)在慢阻肺急性加重期中被放大[8]。

然而在本實(shí)驗(yàn)中通過研究發(fā)現(xiàn)，除了以上機(jī)制，AM可能參與誘導(dǎo)的TGF-β/Smad2/3 蛋白信號(hào)通路或在慢阻肺病程進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。目前發(fā)現(xiàn)TGF 至少有6 個(gè)亞型，但是在人類中僅發(fā)現(xiàn)3 個(gè)同分異構(gòu)體的亞型，分別為TGF-β1/β2/β3，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)幾乎被所有細(xì)胞分泌，并廣泛參與機(jī)體損傷修復(fù)、胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞外基質(zhì)代謝、炎癥、免疫等方面。TGF-β1/β2/β3 是以復(fù)合體形式分泌，三者之間相互關(guān)聯(lián)影響而發(fā)揮自身的調(diào)節(jié)、周邊的調(diào)節(jié)功能，也能通過血液、淋巴液循環(huán)對(duì)遠(yuǎn)處的靶細(xì)胞其相應(yīng)的作業(yè)。多個(gè)證據(jù)顯示TGF-β1 的表達(dá)主要?dú)w因于巨噬細(xì)胞。TGF-β1 被認(rèn)為是目前最關(guān)鍵的致纖維化因子和最強(qiáng)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積的促進(jìn)劑，一方面可促進(jìn)細(xì)胞組織修復(fù)的同時(shí)也在促進(jìn)纖維化的發(fā)生由此引起氣道重塑使氣體流速受限，另一方面能延長Th2 細(xì)胞的生存而使IL-13 生成增加，進(jìn)一步的刺激TGF-β2 產(chǎn)生及釋放，以沒有特異性方式誘發(fā)和導(dǎo)致氣道上皮黏蛋白的過度表達(dá)［3］。與此同時(shí)它還可以促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放，通過一級(jí)一級(jí)的放大加重炎癥的反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞外間質(zhì)代謝失衡、引發(fā)成纖維細(xì)胞激活、積聚、杯狀細(xì)胞的增生、促進(jìn)黏液高分泌。

在以往的多個(gè)研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TGF-β 是通過Smad 蛋白通路從而完成其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的。Smads 蛋白家族中Smad2/3/4/7 可以參與TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)，也是到今天所知曉的細(xì)胞內(nèi)唯一的TGF-β受體作用的底物。未活化的受體調(diào)節(jié)型Smad 蛋白的MH1 區(qū)及MH2 區(qū)相互抑制，發(fā)揮不了其生物學(xué)效應(yīng)，經(jīng)活化后的R-Smad 蛋白其MH1 區(qū)的核酸定位樣序列使Smad 蛋白向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，并與相應(yīng)的靶基因結(jié)合，同時(shí)需要Co-Smads作為中間媒介并保持Smads低聚體的構(gòu)型。TGF-β1/β2/β3 通過該通路，由配體結(jié)合到細(xì)胞表面的TβRII，再激活TβRI 的絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)進(jìn)一步的活化TβRI，形成三聚體，TβRI 再此激活Smad2/3 從而使其磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核，進(jìn)而引起氣道黏膜上皮內(nèi)膠原纖維增生，氣道重塑，出現(xiàn)不可以逆轉(zhuǎn)的氣體流速受限。有的研究得出氣道重塑僅有TGF-β1作用其中而并不包括其他TGF亞型，有研究認(rèn)為[9]，TGF-β3可以促使肺內(nèi)纖維化組織修復(fù)，在修復(fù)的同一時(shí)間下調(diào)TGF-β1 誘導(dǎo)的基因表達(dá)，TGF-β3 可以抑制炎癥引發(fā)的TNF-α 水平上調(diào)，從而減輕炎癥的程度。TGF-β2 則被單獨(dú)發(fā)現(xiàn)有助于增加嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和膠原沉積。

本實(shí)驗(yàn)中研究者發(fā)現(xiàn)，慢阻肺患者氣道黏膜存在程度不一的膠原纖維過度沉積，伴有黏液高分泌，這也是引起慢阻肺急性加重期發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病生基礎(chǔ)。TGF-β1/β2/β3 過表達(dá)在慢阻肺病程中貫穿始終，不能證明TGF-β3 的保護(hù)性作用。通過對(duì)誘導(dǎo)痰研究，我們證實(shí)了AM 在慢阻肺急性加重期中數(shù)量增多且高表達(dá)Smad2/3 蛋白，同時(shí)TGF-β1/β2 高表達(dá)且與AM 數(shù)量、Smad2/3 蛋白顯著正相關(guān)，可以認(rèn)為AM 導(dǎo)致TGF-β高表達(dá)并激活TGF-β/Smad2/3 蛋白信號(hào)通路，引起氣道慢性炎癥和廣泛小氣道膠原纖維沉積，從而導(dǎo)致器質(zhì)性氣流阻塞、肺功能惡化，在氣道重塑中均起著至關(guān)重要的作用，也是導(dǎo)致急性加重的重要且關(guān)鍵的因素之一。通過檢測患者誘導(dǎo)痰中TGF-β1/β2的水平高低可以作反映慢阻肺的嚴(yán)重程度、并對(duì)病情的檢測、療效的觀察以及轉(zhuǎn)歸的判斷起到一定的輔助作用，但其具體的通路及作用方式仍需進(jìn)一步研究。