一個Ⅱ型遺傳性抗凝血酶缺陷導致深靜脈血栓形成的家系分析

薛雁 謝海嘯 徐琦煜 謝耀盛 蔣淑婷 王歡歡 王明山 楊麗紅

抗凝血酶（antithrombin,AT）是機體重要的生理性抗凝物質，主要由肝細胞合成[1]。遺傳性AT缺陷癥是由位于染色體1q25.1的SERPINC1基因缺陷導致的常染色體顯性遺傳的血栓性疾病，大多數突變表現為雜合子[2]。根據血漿AT活性（AT activity，AT∶A）和AT抗原（AT antigen，AT∶Ag）水平，AT缺陷癥可以分為兩型：Ⅰ型表現為AT∶A和AT∶Ag同步降低；Ⅱ型表現為AT∶A降低，而AT∶Ag含量正常。筆者對1例由SERPINC1基因缺陷引起Ⅱ型遺傳性AT缺陷癥導致深靜脈血栓形成的患者及其家系成員進行表型與基因型檢測，并采用生物信息學軟件分析突變位點的致病性和對蛋白結構的影響，探討該Ⅱ型遺傳性AT缺陷癥與深靜脈血栓形成的關系，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者男，74歲。2020年2月16日在家中因突發左側上下肢體無力摔倒被送至當地醫院，頭顱CT檢查顯示右側額頂葉出血進入腦室，隨即予以甘露醇針劑等對癥治療，癥狀無明顯加重，隨后送至溫州醫科大學附屬第一醫院進一步診治。患者既往有高血壓病史5～6年，期間未按照醫囑規范服用降血壓藥，無肝、腎病史及手術史。頭顱MRI檢查結果提示為“右側額頂葉-中線旁病變”，隨即予控制血壓、脫水降顱內壓、抗感染等治療方案，擬“肺部感染、高血壓病、腦出血”收治入院。入院4 d后，先證者B超檢查顯示“雙側下肢大動脈粥樣硬化、兩側小腿肌間靜脈叢血栓形成”，且靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism,VTE）為“高風險血栓形成”。對先證者進行了易栓癥遺傳性危險因素的篩查予以查明血栓形成原因，結果顯示先證者AT∶A降低為32%，其他指標均在正常參考范圍。通過調查該家系成員（3代11人）臨床資料發現，家系成員中只有先證者出現相應臨床表現，家系圖見圖1。采用隨機抽樣法選取本院2020年2月1日至2月14日100名無肝腎功能疾病和異常出凝血疾病的健康體檢者作為正常對照，用于建立實驗室各項指標參考范圍及排除基因多態性可能，其中男50名，女50名，中位年齡54（36，64）歲。本研究經本院醫學倫理委員會批準（倫審201217），研究對象均知情同意。

圖1 遺傳性AT缺陷癥家系圖

1.2 方法

1.2.1 標本采集與處理 采集所有受試者外周靜脈血2.7 ml加入含0.3 ml枸櫞酸鈉（濃度：0.109 mol/L）抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，離心半徑20 cm；分離的乏血小板血漿用于凝血指標檢測；下層血細胞用于提取基因組DNA、PCR擴增及測序。。

1.2.2 血漿凝血指標檢測 在法國Stago公司的STAR-Max自動血凝儀上采用發色底物法檢測AT∶A和蛋白C活性（PC∶A），凝固法檢測蛋白S活性（PS∶A），酶聯免疫吸附法檢測AT∶Ag。所有操作步驟均嚴格按照試劑說明書進行。

1.2.3 PCR擴增基因組DNA 通過Primer Primer 6.0軟件設計覆蓋SERPINC1基因所有外顯子及其側翼序列的引物，并通過基本局部比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool,BLAST）驗證；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列參見文獻[3]；在ABI Thermal cycler 2720擴增儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）上擴增SERPINC1基因組DNA及其側翼序列。擴增完成的PCR產物經純化后送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行測序；采用Chromas軟件將測序結果與NCBI基因庫公布的SERPINC1標準序列（GenBank ID：NG_012462.1）進行比對，尋找突變位點，再反向測序驗證；然后擴增家系其他成員及健康對照組相應位點并測序。

1.2.4 生物信息學軟件分析 采用MutationTaster、PolyPhen-2和LRT生物信息學軟件分析突變氨基酸對蛋白質功能的影響；通過ClustalX-2.1-win多重序列比對軟件分析突變氨基酸的保守性；根據已知蛋白數據庫中AT蛋白模型文件（PDB ID：1ANT）構建三維立體空間模型圖，用PyMol軟件分析突變前后蛋白的空間結構和次級鍵的變化。

2 結果

2.1 表型檢測結果 先證者及其大兒子、二女兒和外孫女的AT∶A顯著降低，分別為正常對照的32%、43%、52%和48%；先證者及其家系成員PC∶A、PS∶A及AT∶Ag指標均無明顯異常，表現為Ⅱ型遺傳性AT缺陷癥。基因檢測結果見表1。

表1 遺傳性AT缺陷癥家系表型和基因檢測結果

2.2 基因型檢測結果 先證者SERPINC1基因第7號外顯子存在c.1346T＞A雜合錯義突變，導致氨基酸第417位的亮氨酸突變為谷氨酰胺（p.Leu417Gln）；其大兒子、二女兒和外孫女也攜帶該突變，家系其余成員該位點均為野生型，見圖2。檢測健康對照組該位點，未發現相同突變，排除了基因多態性可能。經查閱文獻和人類基因突變數據庫，該突變位點鮮見報道。

圖2 SERPINC1基因第7號外顯子測序圖（a：野生型；b：c.1346T＞A突變型）

2.3 生物信息學軟件分析結果 MutationTaster、Poly-Phen-2和LRT 3個在線生物信息學軟件對p.Leu417Gln預測結果分別為1.0分、1.0分和0分，均顯示為“致病的、有害的”。保守性分析顯示Leu417在9種同源物種中高度保守，見圖3。蛋白模型圖顯示，突變前非極性Leu417主鏈與極性Ser52側鏈和極性帶負電荷Glu414側鏈分別形成一條氫鍵，當突變為極性Gln417后，Gln417與Leu126形成一條新的氫鍵，見圖4。

圖3 Leu417位點同源物種保守性分析

圖4 p.Leu417Gln突變模型分析（a：野生型；b：突變型；虛線表示氫鍵）

3 討論

易栓癥是指包括遺傳性和獲得性因素存在而易發血栓栓塞的一類疾病[4]。臨床常見遺傳性因素有蛋白S、蛋白C、AT等抗凝蛋白缺乏以及凝血因子ⅤLeiden和凝血酶原G20210A突變；獲得性因素包括創傷、妊娠、手術和制動、雌激素治療等[5]。本研究中先證者SERPINC1基因第7號外顯子存在c.1346T＞A雜合錯義突變（p.Leu417Gln），其大兒子、二女兒和外孫女也攜帶該突變。根據已檢測的AT∶A和AT∶Ag結果發現4名攜帶p.Leu417Gln雜合錯義突變的家系成員AT∶A均有不同程度的降低，而AT∶Ag無明顯異常，4名家系成員均不存在肝腎疾病史，初步認定為Ⅱ型遺傳性AT缺陷癥并且p.Leu417Gln雜合錯義突變可能是導致該家系AT∶A降低的主要原因。

本研究中攜帶p.Leu417Gln突變的先證者與其3名家系成員均表現為AT∶A降低，先證者下肢深靜脈血栓形成出現于因“高血壓病、肺部感染、腦出血”被本院收治，其他3名家系成員均無相應臨床癥狀，因此推斷該雜合突變在其他危險因素存在時可能引起血栓形成。臨床研究中，早期血栓形成、血栓家族史、復發性和突發性血栓等血栓形成事件皆與AT缺陷癥相關。40%VTE形成與高齡、妊娠、高血壓、吸煙、外科手術和長期制動等危險因素相關，60%VTE是由AT缺陷癥自發形成[6]。該先證者由于同時存在長期制動、高血壓、高齡等易栓因素，p.Leu417Gln雜合錯義突變可能是另外一個易栓誘因。3個生物信息學軟件分析顯示p.Leu417Gln突變為“致病的、有害的”，可能會導致AT缺陷，進一步驗證了筆者推測。本研究通過PyMol蛋白模型分析軟件分析野生型AT蛋白在p.Leu417Gln突變后對空間結構和次級鍵的改變，結果顯示：野生型AT蛋白非極性Leu417突變為極性Gln417后，與Leu126之間增加了一條氫鍵，這可能會導致局部分子間空間結構的改變。保守性分析結果為高度保守，表明該位點氨基酸對AT蛋白的結構形成和功能運用中起到重要作用。AT蛋白是一種由432個氨基酸組成的糖蛋白，二級結構具有3個β-折疊和9個α-螺旋。臨床上常見導致PE型缺陷的基因位點均位于由s1C與s1C-s4B相連接的遠端鉸鏈區域[7]。現今報道的PE型缺陷如 p.Pro407Leu[8]、p.Val426Gly 和 p.Phe408Ser[9]、p.Arg425Thr[10]等主要位于7號外顯子C末端。本研究中探討的位于s4B與s5B連接處的p.Leu417Gln突變位點鄰近其他報道的PE型突變位置，故此p.Leu417Gln雜合錯義突變也可能有相似致病機制導致PE型缺陷。

綜上所述，本研究通過對一個遺傳性AT缺陷癥家系表型和基因分析，分析了先證者出現下肢深靜脈血栓形成可能與p.Leu417Gln雜合錯義突變有關；進一步采用在線生物信息學軟件及Pymol蛋白分析軟件，初步探討了其致病機制，但其確切的分子致病機制仍需進一步研究探討。