超聲響應下載藥納米材料在腫瘤靶向治療中應用研究進展

朱江 王敏言

近年來，使用非侵入性手段刺激特定刺激響應納米材料來輔助腫瘤靶向治療已經成為了一個重要的研究領域。常用的非侵入性物理刺激有4種類型：超聲波、光、電場和磁場。刺激響應納米材料可以用于輔助藥物遞送、癌癥治療和組織工程。非侵入性物理刺激和刺激響應納米材料的結合可以增加藥物在靶組織積累及釋放的可控性，降低藥物的非特異毒性，提高藥物的傳遞效率，帶來更好的治療效果。筆者將專注于超聲波控制藥物釋放在癌癥治療中的作用，就超聲波作為刺激源的原理、超聲波對材料的影響，以及如何與納米材料協同作用作一述評。

1 超聲波的定義與發展歷史

1.1 超聲波的定義 聲波是由物體振動產生的一種機械波，每秒的振動次數稱為頻率，人耳可聞及的頻率范圍為16～20 kHz。超過人耳聽覺閾值即頻率＞20 kHz的聲波為超聲波，簡稱超聲[1]。

1.2 超聲波的發展歷史 19世紀40年代，維也納大學的神經學專家Dussik等[2]通過超聲波透過顱骨診斷腦損傷和定位腦室后，超聲波開始應用于醫學診斷。而早在超聲波用于醫學診斷之前，就發現其具有治療能力。1927年Wood等[3]描述了超聲波治療后組織的持久變化。20世紀40年代，美國哥倫比亞大學的Lynn等[4]提出用超聲波加熱治療的建議。到20世紀70年代末，超聲波的熱效應廣泛應用于癌癥的靶向治療。高強度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound,HIFU）治療腫瘤的主要機制，即超聲波的熱效應，近20年來HIFU已經成為了傳統腫瘤治療的替代方案之一。

2 超聲生物學效應

超聲生物學效應是超聲波治療的基礎。超聲波作用于人體會產生一系列生物學效應，主要包括熱效應和非熱效應，其中非熱效應又包括空化效應和超聲輻射力。

2.1 熱效應 每當超聲波傳播到諸如組織之類的物質中時，波的幅度會隨著距離的增加而減小，這種衰減是由于吸收或散射造成的。吸收是一種機械能轉化為熱能的一種機制，散射被認為是改變波傳播方向的機制。因為介質可以吸收能量來產生熱量，所以只要產生熱量的速度大于熱量排出的速度，溫度就會升高[5-7]。一定強度的超聲波在人體內傳播時，超聲波的能量被組織吸收，較高的能量沉積（＞55℃）會引起組織細胞內的蛋白質凝固、變性和壞死，這是HIFU治療的主要工作原理，較低的能量沉積（＜55℃）可以誘導細胞通透性增加，從而加強納米級別的物質進入細胞，加強超聲激發療法的療效[8]。

2.2 非熱效應

2.2.1 空化效應 空化效應是指在超聲波作用下，液態介質中的微小氣泡被激活后，產生震蕩、膨脹、收縮以及內爆等一系列復雜的動力學過程，這被認為是促進藥物靶向輸送的主要機制[9-10]。空化效應可以分為慣性空化和穩定空化。

慣性空化是當微氣泡在聲學循環的一部分期間膨脹，然后由于不規則振蕩和空腔的快速增長而迅速塌陷的過程，這導致微氣泡碎裂成多個更小的微泡。在微氣泡崩塌期間，流體中會產生沖擊波，形成微射流。有研究證明，沖擊波和微射流會產生非常大的力，可以穿透細胞膜，甚至滲透血管[11-12]。沖擊波、微射流及隨后的聲孔效應都可以誘導細胞攝取小分子和高分子量的藥物。穩定空化是指微氣泡在低聲壓下對稱性壓縮和膨脹，氣泡直徑保持相對恒定而不破裂，這種穩定的振蕩會在微氣泡周圍產生液體流，即“微流束”[13]。當這些振動的微氣泡靠近細胞時，會對這些細胞產生剪切應力。剪切應力水平在很大程度上取決于超聲波參數，其參數范圍一般在100～1 000 Pa[14]。這些穩定的振蕩也可能促進大分子藥物和納米顆粒的細胞內輸送。Forbes等[15-16]研究發現，在低于慣性空化閾值強度的聲波暴露下，細胞可攝取異硫氰酸熒光素標記的右旋糖酐，相比之下，穩定空化微泡需要與細胞直接接觸才能影響細胞膜，慣性空化微泡的影響范圍更大。

2.2.2 超聲輻射力 超聲波對位于其傳播路徑上的吸收或反射體會產生一種具有單一方向的作用力，這就是超聲輻射力[17-18]。超聲輻射力可分為主輻射力和次輻射力。前者能改善藥物和基因載體沿波傳播方向向血管外滲漏，后者效應會增加單個氣泡之間的振蕩、相互吸引和聚集。脈沖HIFU產生的輻射力可以選擇性地促進脂質體阿霉素（doxorubicin,DOX）[19]、對比劑[20]和裸DNA[21]的傳遞。

3 超聲激發載藥納米粒在腫瘤靶向治療中的應用

3.1 靶向傳遞化療藥物 20世紀80年代，熊本大學醫學院的Matsumura等[22]發現腫瘤血管對大分子化合物具有高度的滲透性，這些大分子化合物進入腫瘤組織后，會在腫瘤組織內滯留較長時間，他們用“增強通透性和保留效應”（enhanced permeability and retention effect,EPR effect）這一術語來描述實體瘤血管系統的獨特病理生理現象。EPR effect是化療藥物被動靶向的基礎，而超聲波可以作為一種相對無害的非侵入性刺激，以增強癌癥化療藥物的作用，而且可以在特定部位實現。

當超聲與化療藥物聯合使用時，能加強被動靶向作用。早在1982年，Hahn[23]試圖確定熱效應是否會影響博來霉素對小鼠的輻射誘導纖維肉瘤（radiationinduced fibrosarcoma,RIF）的療效。他們通過水浴加熱、射頻輻射和超聲波熱療誘導3種方法來實現熱療，結果表明通過超聲波熱療誘導的治愈率最高。2002年，Feril等[24]回顧了超聲波在增強抗腫瘤藥物療效方面的應用，并回顧了一系列研究，這些研究報道了在升溫不明顯的情況下增強抗腫瘤藥物效應。他們提出了一些可能的機制：（1）超聲波誘導細胞膜通透性增加；（2）超聲波誘導靶細胞對相關藥物的敏感性增加；（3）超聲波誘導藥物修飾；（4）超聲波或藥物單獨引起的局部損傷，這些機制綜合作用下導致細胞死亡。

為了進一步增強化療藥物的靶向作用，超聲波控制的藥物遞送平臺不斷被開發。Dromi等[25]利用脈沖高強度聚焦超聲（pulsed high-intensity focused ultrasound,p-HIFU）的熱效應聯合熱敏脂質體，在小鼠上實現DOX靜脈注射后于腫瘤處局部釋放，與單獨給藥或非熱敏脂質體載藥相比，p-HIFU聯合熱敏脂質體載藥有效利用了脂質體和熱療的雙重優勢，顯著增加DOX傳遞的效率，降低腫瘤生長速率。Rapoport等[26]通過將全氟戊烷與聚合物膠束包裹在一起，制備了負載DOX的聲敏（相變）納米顆粒，結果發現在生理溫度下，液體納米液滴轉化為微米級氣體；DOX穩定地保留在微泡中，但在超聲波照射下釋放；同時，微泡的空化效應增加了腫瘤細胞的藥物攝取。

微泡最初被設計用于輔助超聲診斷，但超聲的空化效應為其提供了許多可能性。大多數微泡的直徑約為2～8 μm，因此可以在整個血管系統中自由循環。微泡制劑一般由蛋白質、脂質或聚合物組成的外殼，由空氣、六氟化硫（sulfur hexafluoride,SF6）或更常見的氟化碳氣體內核組成。部分微泡使用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）等試劑進一步穩定脂質殼，這也有助于逃避網狀內皮系統（reticuloendothelial system,RES）的吞噬，從而延長在血液中循環時間[27]。作為超聲響應納米級材料，由于其物理特性，基于微泡的藥物可以實現超聲實時監控下的腫瘤治療。這樣非侵入性實時監測的方法能應對不同腫瘤結構或手術治療禁忌等情況提出的挑戰。為了增強微泡在靶組織的有效積累，有研究進一步開發了基于微泡分子水平的靶向藥物遞送系統。Wu等[28]研究證實，A10-3.2靶向前列腺特異性膜抗原的適配體偶聯的納米泡（nanometer bubbles,NBs）形成前列腺特異性膜抗原（prostate-specific membrane antigen,PSMA）特異性的靶向超聲對比劑，對人前列腺癌荷瘤裸鼠模型中過度表達的PSMA存在特異性。

超聲波控制的藥物遞送平臺達到提高局部藥物或基因的濃度、使藥物避免被肝臟攝取、延緩藥物釋放、減少給藥次數、減小給藥劑量、增加藥物療效和減輕全身不良反應的目的。

3.2 靶向傳遞基因 基因治療是將正常基因導入靶區域組織細胞來糾正或補償異常或缺陷基因，以達到治療疾病的目的[29]。在上述方法中，超聲結合微泡、脂質體等超聲響應納米粒可以為非侵入性控制藥物在體內特定靶點沉積提供基礎。基因治療成功的關鍵在于：（1）治療性核酸必須有效地輸送到所需的作用部位；（2）治療性核酸到靶部位后，必須通過細胞膜運輸入該部位的靶細胞。本質上，這些挑戰與以上提到增強癌癥化療藥物作用的超聲波控制藥物遞送平臺類似。迄今為止，大多數基因治療采用方法是使用基于病毒的載體系統來實現治療性核酸向靶細胞的遞送，因為病毒提供了進入細胞內空間的理想方法。然而，臨床實踐發現，病毒載體系統可能對患者造成嚴重不利影響，其中包括引發不良免疫反應以及與癌基因啟動子/基因附近的序列整合相關的挑戰[30-31]。

超聲介導的基因傳遞是治療癌癥的一個極具吸引力的選擇，微泡和脂質體都能作為超聲介導基因傳遞的有效載體。微泡被設計成直接將DNA結合在其外殼上或在其核心包含遺傳物質。在這樣的系統中，微泡既是空化核又是血管內基因載體系統。

Wu等[32]使用siRNA與磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,GPC3）結合的靶向納米泡聯合低頻超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD）有效轉染肝細胞癌細胞（hepatocellular carcinoma,HCC）。結果表明，這些納米泡有良好的靶向HCC的能力，并且顯著提高了HCC中神經上皮細胞轉化基因1（neuroepithelial cell transforming gene 1,NET-1）的沉默。

也有報道稱，由于DNA和RNA的磷酸骨架為負電性，陽離子微泡（cationic microbubbles,CMBs）可以增強DNA的承載能力。Kopechek等[33]將帶有信號轉導子和轉錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）誘餌的陽離子脂質用微泡包裹輸送到鱗狀細胞癌中，在超聲波輻射下，STAT3信號在體外和體內均受到抑制，顯著抑制腫瘤生長，降低下游靶基因表達。Xu等[34]聯合UTMD和脂質體轉染短發夾RNA（short hairpin RNA,shRNA），明顯抑制MCF-7細胞系中異黏蛋白（metadherin,MTDH）的表達，從而降低細胞活力，減少細胞遷移、侵襲和上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），進一步證明了超聲波可以非侵入性地促進體內基因轉移以及微泡的存在顯著影響了基因表達。

總之，超聲波介導下的基因傳遞在基因療法治療癌癥方面具有巨大的潛力。超聲波可以在基因表達或抑制方面提供一種時間、空間特異性的外部刺激，可作為單獨治療手段，也可以基于化療，提供進一步的個體化治療。

3.3 聲動力療法（sonodynamic therapy,SDT） SDT這個術語源于光動力療法。然而，與光動力療法光敏劑直接由光激發產生活性氧（reactive oxygen species,ROS）不同，SDT是通過超聲波誘導的空化和聲敏劑介導產生自由基，殺死附近快速分裂的癌細胞。可見光在組織中衰減迅速，穿透性有限，只能在表面或術中使用，但聲波可以到達組織深部，更具應用潛力，但是SDT的機制仍未明確。目前最有說服力的解釋是：ROS是由超聲波引起的空化效應產生，其次是聲致發光和熱解。在超聲波的輻射下，氣泡會成核、生長、爆炸，也就是空化效應，氣泡爆炸中產生的能量會產生光，產生“空穴-電子”對，繼而產生ROS或激活聲敏劑，通過系統間交叉（intersystem crossing,ISC）產生ROS[35]。空化效應能產生巨大的能量，但是能量在局部釋放和冷卻速度快，在臨近組織中的不良反應很小。這個過程中，聲敏劑可能被分解成自由基，顯著增強治療效果，它們被認為是SDT的重要組成部分。在過去的幾十年中已經開發不同類型的聲敏劑有：有機分子[36-39]、無機納米材料[40-41]、雜化物[42]和金屬基系統[43-44]等。大多數聲敏劑都有疏水性，容易在生理環境中發生聚集，從而影響其藥代動力學特性。借助納米技術，使用聲敏劑聯合超聲可以有力克服這些限制。封裝的納米粒子可以作為聲敏劑，提高SDT效率。此外納米粒子通過降低空化閾值，為空化泡的產生提供了更多的成核位點。卟啉類似物如4-甲基苯基卟啉（tetraphenylporphyrin,TTP）、血卟啉單甲醚（hematoporphyrinmonomethyl ether,HMME）和原卟啉Ⅸ（protoporphyrin IX,PpⅨ），在SDT中獲得了較多的關注，例如Ma等[36]使用猛（manganese,Mn）、鋅（zinc,Zn）、二氧化鈦（titanium dioxide,TiO2）3種金屬及金屬氧化物合成了金屬卟啉配合物：Mn-TTP、Zn-TTP和TiO2-TTP，并使用人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）包被配合物，可以在11 cm的深層組織中表現出優異的超聲激活能力。除此之外，無機納米聲敏劑在體外超聲誘導SDT效應方面也具有較高的穩定性，其中基于TiO2半導體納米聲納傳感器已在癌癥治療中得到探索。Deepagan等[45]開發了親水性Au-TiO2納米復合材料（HAu-TiO2NCs）作為改進SDT的聲敏劑。他們研究了HAu-TiO2納米碳素的物理化學性質，并與未沉積金的納米碳素進行了比較。HAu-TiO2NCs經超聲照射后產生大量ROS，在體內系統給藥后可完全抑制腫瘤生長。這些研究結果提示，聲動力療法可能在未來給癌癥的靶向治療提供一個替代方案。

綜上所述，超聲波激發的藥物遞送平臺在臨床藥物遞送治療和提高治療效果方面有獨特的應用前景。本文描述了超聲激發載藥納米粒在腫瘤治療中的各種應用策略，但盡管超聲激發療法已經取得很大進展，但在臨床實踐中仍有許多困難需要解決，例如介質作為外來物質，容易引起體內免疫反應，其次介質的靶向性需要進一步增強，另外介質在體內的藥代動力學也需要被研究者們研究。希望這些問題能夠隨著未來超聲激發療法的進一步研究而得到解決。