畜禽糞便堆肥過程中微生物群落演替

王孝芳 萬金鑫 韋中 徐陽春 沈其榮

（南京農業大學資源與環境科學學院/江蘇省固體有機廢棄物資源化高新技術研究重點實驗室/江蘇省有機固體廢棄物資源化協同創新中心/資源節約型肥料教育部工程研究中心/國家有機類肥料工程技術研究中心，南京 210095）

近年來，隨著我國畜禽養殖業的集約化發展，畜禽的養殖數量和規模不斷擴大。有研究報道，截至2020年，我國畜禽養殖業每年產生 38 億t畜禽糞便，但是畜禽糞便的利用率僅有 60%［1］。堆肥能夠對畜禽糞便進行無害化、資源化處理，具有產品肥效高、環境污染低及產量高等優點，被認為是畜禽糞便處理的高效途徑之一［2-3］。畜禽糞便堆肥是利用廣泛存在于自然界的微生物通過一系列的生物化學反應，殺死畜禽糞便中的有害病原微生物及寄生蟲卵等，將畜禽糞便中不穩定的有機物質分解轉化合成為穩定的腐殖質的過程［4-5］。目前大多數研究還是關注不同處理下特定畜禽糞便堆肥過程中的理化特性及微生物群落的變化［5-7］，但因堆肥物料、堆肥體系、堆肥方法等不同，微生物群落差異較大，尚缺乏對畜禽堆肥微生物群落結構和功能演替的系統總結和認知。本文梳理了畜禽糞便堆肥過程中不同階段細菌、真菌等微生物群落結構和功能的演替規律；總結了堆肥起始物料的特性（含水量、pH、C/N等）和人為活動（翻堆曝氧、菌劑接種）對堆肥微生物群落演替的影響；比較了當前堆肥微生物群落的研究方法；最后展望了未來畜禽糞便堆肥研究值得重視的科學問題和研究方向。

1 畜禽糞便堆肥微生物群落結構的演替

好氧堆肥的本質是微生物的生化反應，堆肥過程中微生物對有機物的分解、轉化、合成起著主導作用。一般根據堆體溫度的變化，可將堆肥過程大致為3個階段：升溫階段、高溫階段、降溫腐熟階段。堆體溫度的變化影響了微生物的活性，驅動微生物的演替，同時也受到微生物活動（釋放熱能）的反饋調節。堆肥微生物主要由細菌、真菌、原生生物、病毒等組成［8］，這些微生物主要來自起始的堆肥物料以及從堆肥的環境中招募獲得［9］。隨著各階段有機物質的分解，堆肥體系中各種生化指標不斷變化，不同微生物交替占據優勢，獨立或者協同其它微生物對有機物質進行分解轉化，促進堆肥的腐熟［10］。堆肥微生物群落結構的演替與堆肥過程以及堆肥腐熟程度密切相關，因此研究堆肥微生物群落組成及演替有助于理解堆肥過程中物質轉化的生物學機制。

1.1 細菌

細菌是堆肥中分布最廣、數量最多的生物，占80%-90%［8］。憑借高生物量和大比表面，細菌能夠快速利用堆肥物料中易分解的碳氮，如假單胞菌屬（Pseudomonas）主要降解脂肪［11］，芽孢桿菌屬（Bacillus）主要降解淀粉和蛋白質［12］。細菌利用初始階段堆體中的可溶性、易降解的化合物，快速增殖，此時細菌的豐度和多樣性達到最高。隨著堆體溫度升高，嗜溫細菌的數量不斷減少，一些嗜熱細菌開始增殖。高溫階段的細菌以芽孢桿菌屬為主，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、環狀芽孢桿菌（Bacillus cyclicus）等能耐受65-80℃的高溫。這些芽孢桿菌屬細菌通過形成內生孢子或厚壁孢子耐受高溫、腐蝕、營養物缺乏等不良環境條件［13］。放線菌是一類特殊的細菌，因其對溫度和pH強的耐受力，能夠通過分泌一些胞外酶分解木質纖維類的復雜化合物，且在高溫條件下分解纖維素、角質素等，成為堆肥高溫期和降溫腐熟期分解木質纖維素的優勢種群。其中鏈霉菌屬（Streptomyces）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、單孢子菌屬（Monosporium）和節桿菌屬（Arthrobacter）等都是堆肥中常見的放線菌，對堆肥體系中木質纖維素的降解有著重要作用［14］。一般放線菌生長緩慢，但在低（貧）營養水平時，尤其是堆肥的中后期，具有強的競爭優勢［15］，豐度快速增加，進一步促進堆肥中難分解有機物的分解利用［16］。不同研究報道的畜禽糞便堆肥中優勢細菌存在一定差異，以豬糞堆肥為例，Li等［17］發現接種1%的復合微生物菌劑增加了高溫期玉米秸稈豬糞堆肥中黃桿菌屬（Flavobacterium）的相對豐度，降低不動桿菌屬（Acinetobacter）的相對豐度；Zhou等［18］發現添加生物質炭增加了豬糞堆肥過程中糖單胞菌屬（Saccharomonospora）的相對豐度；Wang等［19］也發現木屑豬糞堆肥中細菌群落以芽孢桿菌目（Bacillales）和梭菌目（Clostridiales）為優勢菌。雖然都是豬糞堆肥，但不同來源豬糞的物質組成存在一定的差異，同時堆肥初期添加輔料的種類、比例也會影響堆肥中細菌群落的演替。

1.2 真菌

真菌是降解木質纖維素類難降解物質的主要菌群［20-21］，研究表明子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）可以分泌多種纖維素和半纖維素降解酶，例如粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）可以分泌纖維素降解酶和木聚糖降解酶［22-23］，黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）能夠分泌纖維二糖水解酶、降解半纖維素的木聚糖酶和纖維素內切酶等酶類［24］。除此之外，真菌還可以憑借菌絲的穿透能力，物理性破壞植物表面的角質層，增加底物與木質纖維素降解酶的接觸，加快木質纖維素的降解。與細菌相比，真菌對高溫的耐受能力較弱，所以主要是在堆肥的升溫和后期的降溫腐熟階段發揮作用。多項研究表明真菌中的子囊菌門、擔子菌門是畜禽糞便堆肥過程中普遍存在的優勢菌門［25-27］。Mao等［28］研究發現雞糞堆肥初期念珠菌屬（Candida）相對豐度高達69.8%，但高溫期降至22.6%，同時隱球酵母屬（Cryptococcus）和葡萄孢屬（Botrytis）豐度大大增加。其中Botrytis可以產生一種熱休克蛋白，在高溫條件下保護Botrytis的活性，還可以在去木質化過程中分泌胞外酶［29］。堆肥腐熟期閉小囊菌屬（Kernia）成為優勢物種，占到80.9%，在富含纖維素的牛、鹿、馬、羊的糞便中經常能發現該物種［30］。Wang等［19］發現豬糞堆肥中真菌散囊菌目（Eurotiales）主導初始和腐熟時期，一些屬于Eurotiales目的真菌可以降解頑固的物質，如脂肪族化合物、氯酚和多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）［31］。在堆肥體系中，真菌對堆肥物料的分解轉化和促進堆肥產品的腐熟穩定具有重要的意義。

1.3 其他微生物

原生動物是一類以細菌或真菌為食的初級消費者，根據其生態功能可分為自養型、共生型、吞噬型和腐生型原生動物［32］，其中腐生型原生動物對堆肥中有機物質的分解具有重要作用［33-34］。另外原生動物傾向于捕食含氮量高的細菌［35］，所以可能影響了堆肥過程中的氮循環。一般原生動物存在于堆肥的水滴中，數量相對較少，其行為與細菌類似［8］。目前堆肥中原生動物相關的研究較少。噬菌體作為一類專性侵染細菌的病毒，也廣泛存在于堆肥當中。基于“殺死勝利者”（kill the winner）假說，群落中越是占據優勢的宿主菌，越容易被裂解性噬菌體裂解［36］，所以噬菌體勢必會影響到堆肥群落中細菌群落的演替。除此之外，噬菌體能夠通過裂解細菌促進顆粒有機物向可溶性有機物轉化，在微食物環中形成了病毒回路（virus shunt），影響物質的循環［37］。目前堆肥中噬菌體相關的研究僅僅是從堆肥中分離獲得如伯克氏菌（Burkholderia）［38-39］、耐萬古霉素糞腸球菌（vancomycin-resistant Enterococcus faecalis）［40］等不同病原菌的噬菌體，研究噬菌體的基礎特性，并未關注噬菌體對堆肥過程微生物和物質變化的影響。所以未來堆肥相關的研究還可以關注堆肥過程中的原生動物和噬菌體群落的結構及其功能。

不同畜禽糞便堆肥具有特定的微生物組成，其變化也不盡相同。如豬糞堆肥中厚壁菌門（Firmicutes）占 主 導 地 位［41］，而 變 形 菌 門（Proteobacteria）在牛糞中更為豐富［42］。就真菌而言，已發現子囊菌門和擔子菌門是雞糞和牛糞中的核心門［9］。這種變化可能與糞便微生物群落組成的初始差異有關，由動物的飲食和腸道微生物群組成決定［43-44］。一般來說，食肉動物食用蛋白質含量明顯高于食草動物的食物［45］。這種飲食差異可能會對糞便微生物群的組成產生影響［46］，與雜食動物相比，食草動物的腸道微生物組已被證明更加多樣化［47］。Wan等［48］比較了4種畜禽糞便（食草動物：牛和羊，雜食動物：雞和豬）堆肥起始和結束時期微生物組成的差異，結果發現細菌和真菌群落根據畜禽食性分為兩組：食草動物（綿羊和牛）和雜食動物（豬和雞）。與豬和雞糞堆肥相比，羊和牛糞堆肥具有更高的細菌和真菌多樣性；羊和牛糞堆肥初期以變形菌門為主，厚壁菌門在豬糞和雞糞堆肥中占主導地位，且在堆肥過程中相對豐度增加。以真菌為例，在整個堆肥過程中，子囊菌在所有糞便處理中占主導地位；在堆肥后期，牛羊糞堆肥中嗜熱鏈球菌屬（Mycothermus）相對豐度較高，而豬、雞糞堆肥中以熱白絲菌（Melanocarpus）為主。所以即使畜禽糞便種類多樣，但一定程度上可以根據畜禽糞便的初始特性預測堆肥過程中微生物群落的組成和變化。

2 畜禽糞便堆肥過程中微生物群落功能的 演替

微生物驅動畜禽糞便堆肥的本質是通過復雜的代謝過程實現的。分析堆肥過程中微生物群落結構和功能是建立堆肥特性、群落和代謝之間關系的基礎。微生物主要通過分泌胞外水解酶降解由復雜大分子組成的有機物質［49］，而分解產生的水溶性化合物可為微生物生長提供資源，確保了微生物降解過程的連續性。有機物的生物降解轉化過程需要脫氫酶、纖維素酶、β-糖苷酶和蛋白酶等多種酶的共同作用。脫氫酶活性因其在呼吸鏈中的功能而被認為是評價生物活性的一般指標［50］。因此，脫氫酶活性的變化可用于監測堆肥狀態并提供有關堆肥成熟度的信息［51］。纖維素酶、β-糖苷酶和蛋白酶分別與纖維素的降解、糖苷的降解和蛋白質中氮的礦化有關［51］。因此，對這些酶活性的監測有助于進一步了解有機物的生物降解過程。有研究發現堆肥過程中纖維素酶活性一般先上升后下降，可能是由于前期分解纖維素的微生物生長緩慢，高溫期有機物快速降解；蛋白酶活性在堆肥過程中呈下降趨勢，與蛋白類底物逐漸減少有關；脫氫酶被證實與微生物活性有關［52］。一些研究還測定了堆肥中分離獲得的單一菌株的產酶降解能力，如熱單孢菌（Thermomonospora）在堿性高溫條件下產生羧甲基纖維素酶降解纖維素［53］，絲狀真菌可以分泌纖維素氧化酶和半纖維素酶降解小麥秸稈［54］，家禽糞便堆肥中分離的耐熱細菌馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）能在pH 10.5和70℃時分泌果膠酸裂解酶［55］。

然而，堆肥中物質的分解是不同微生物協同代謝的結果，不能簡單地通過幾種酶活或分離培養來評估。目前基于宏基因組學分析的PICRUSt和FUNGuild可以分別基于高通量測序數據預測堆肥中細菌和真菌的功能多樣性［56-58］。PICRUSt預測細菌功能具有較高的準確性，且被用于醫學領域預測藥物和疾病對動物/人類細菌代謝的影響［59-60］。FUNGuild數據庫包含 9 476條真菌屬和種級別的序列，可以根據營養模式將真菌序列分為12個功能組［58］。這兩種生物信息學工具為理解堆肥過程中微生物功能演替提供了潛在方法。Ding等［61］比較了不同堆肥系統中細菌代謝功能的差異，結果發現生物反應器堆肥中氨基酸代謝相關基因的相對豐度最高，而傳統堆肥中碳代謝相關基因的相對豐度最高。Mao等［28］發現雞糞堆肥中真菌腐生功能基因的相對豐度隨時間逐漸降低，堆肥30 d后，參與檸檬酸循環、糖酵解等碳水化合物代謝的基因豐度增加。Wang等［19］研究發現豬糞堆肥過程中細菌的糖代謝、脂類代謝和多糖合成代謝相關基因的豐度在堆肥前期比較高，而真菌的木材、糞便和植物腐生功能相關基因的豐度在堆肥后期比較高，一定程度說明細菌和真菌交替發揮作用。

3 畜禽糞便堆肥微生物群落演替的影響因子

畜禽糞便堆肥過程中微生物群落的動態演替受到多種因子的調控，因為微生物的生長繁殖與堆肥體系中的環境因子的變化密切相關。影響微生物群落演替的因子可以分為兩組：（1）取決于堆肥起始物料的組成，如含水量、pH、C/N等；（2）人為管理過程，如翻堆曝氣、菌劑接種等。

3.1 堆肥起始物料特性

糞便中含有大量的營養物質，尤其是禽類，消化道短，攝取的飼料不能被完全吸收，很大一部分營養物質會隨糞便排出體外［62］。所以畜禽糞便堆肥初始物料的特性一定程度上受畜禽食性的影響［9］，根據食性一般可以將畜禽分為兩大類：食草性和雜食性。一般食草動物以粗飼料、粗纖維為主，而雜食動物的飼料中含有更多的粗蛋白質［43］。所以草食性動物如牛、羊糞便中可能含有更高的碳；而雜食性動物如豬、雞糞便中可能還有更高的氮［43，63］。Wan等［48］研究發現在羊和牛糞堆肥具有較高的 pH、硝態氮（NO3-N）、總碳（TC）含量和 C/N，而豬糞和雞糞堆肥具有更高的 EC、銨態氮（NH4-N）、總氮（TN）和總磷（TP）。盡管不同研究中堆肥的起始物料存在差異，但基于畜禽食性可以初步判斷糞便堆肥的理化特性和物質降解規律［43］。

含水量：微生物活動需要水作為介質，水中的營養物質維持了微生物的代謝。大量水分蒸發的同時會帶走熱量，從而對堆肥的溫度也起到調節作用。新鮮的畜禽糞便一般含水量較高，容易導致堆體的孔隙減少，氧氣含量不足，形成厭氧發酵［64］。研究表明，堆肥起始的最適含水量是50%-60%［65］，隨含水量的減少，微生物的分解速率也會降低。故堆肥體系的含水量會直接影響著微生物的生長代謝過程，從而影響著堆肥反應速度和腐熟程度。

pH：微生物對pH的耐受范圍較廣，5.5-8.0之間都能維持良好的微生物活性［4］。常見堆肥原始物料的pH都在此范圍內，畜禽糞便的pH一般呈弱堿性，有利于微生物的生長繁殖。堆體過程中pH是變化的，堆肥初期，微生物降解有機質過程中釋放的有機酸可能會使pH降低；隨著堆肥的進行，氨揮發會使堆體的pH呈現上升的趨勢［66］。

C/N：微生物的生長繁殖需要碳源和氮源，合適的C/N是影響微生物代謝的關鍵［67］，一般堆肥物料起始C/N會控制在20-35之間。高C/N時，微生物可降解的底物多，堆肥進行緩慢；低C/N時，氮素過剩，易導致氨揮發或從堆肥中浸出而造成氮損失，進而減緩有機物料的降解進程。一般禽畜糞便的C/N較低，以禽畜糞便為主進行堆肥時一般選用高C/N比的農作物秸稈、木屑、鋸末、稻草等作輔料來調節堆體的 C/N值［7］。

3.2 人為管理過程

翻堆曝氣：畜禽糞便好氧堆肥過程中適當的翻堆曝氣可以控制堆肥的溫度、去除多余的水分、為微生物提供充足的氧氣。如果堆體氧氣不足，會抑制好氧微生物的獲取，同時厭氧發酵過程中產生的有害物質會進一步抑制微生物，減緩了堆肥的進程，造成堆肥腐熟不徹底。最佳的氧氣濃度在15%-20%之間［4］，有利于好氧堆肥的進行。另外，定期翻堆能夠影響堆體的溫度，一般翻堆后堆體的溫度會有所下降，但會在短時間內上升，主要是因為翻堆為微生物活動供應了充足的氧氣，微生物繼續分解底物產生了熱量。堆肥的最佳溫度在40-65℃［4］，溫度過低不利于物質的降解，溫度過高會降低微生物的活性。

菌劑接種：為了加快堆肥中有機物的降解速率，提高堆肥的腐殖化程度，可以通過向堆體添加微生物菌劑來增加微生物的豐度，調節堆肥微生物的菌群結構，促進堆肥的快速腐熟［68］。有研究表明接種有機肥起曝劑，能夠加快豬糞堆肥堆體的升溫速率，促進堆體提前進入高溫期，提高了堆肥的腐熟效率［69］。Jiang等［70］發現10℃低溫條件下，接種出芽短梗霉（Aureobasidium paleasum）DW-1后雞糞秸稈堆肥快速進入高溫期且腐熟產品具有更高的種子發芽率。

4 堆肥微生物群落及其功能的研究方法

4.1 傳統的微生物研究方法

微生物分離培養和顯微計數等傳統研究方法是早期分析堆肥微生物的經典方法。首先確定目標微生物，采用選擇性培養基篩選獲得菌落，進行計數或進一步鑒定菌株的種屬信息。López-González 等［71］從堆肥中分離鑒定了4 000多株細菌，屬于187個細菌種，這些細菌大多數具有耐熱能力且表現出一定的酶促降解能力。但因為堆肥中的微生物是動態變化的，且可培養微生物只占環境微生物總量的0.1%-1%，所以分離培養法評估堆肥微生物時誤差大。顯微計數是利用顯微鏡觀測樣本中的細胞數量，雖然結合核酸染色可以區分死活細胞［72］，但工作量大，操作繁瑣，耗時耗力。

4.2 分子生物學研究方法

與傳統的微生物研究方法相比，現代分子生物學方法具有靈敏度高、數據量大等優點，為原位揭示堆肥微生物群落的組成和功能開辟了新途徑。堆肥體系中微生物群落結構復雜，微生物數量巨大，分子生物學方法能在追蹤微生物數量變化的同時，對物種分類、自然進化進行全面客觀的分析。目前堆肥微生物的分子生物學研究方法主要包括變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、磷脂脂肪酸譜圖分析（phospholipids fatty acids，PLFAs）、熒光定量 PCR、高通量測序技術等。Cherif等［73］利 用DGGE和ARISA（automated ribosomal intergenic spacer analysis）指紋圖譜方法研究了不同城市固體廢棄物堆肥改良土壤中細菌群落的結構和多樣性。Tkachuk等［74］利用靶向 16S rRNA 高通量測序描述了病死畜禽堆肥的微生物群落。這些分子生物學方法在數據量的大小、測序精度和深度上有各自的優缺點，需要根據特定的堆肥體系和研究目標進行選擇。

4.3 整合多組學研究方法

由于堆肥體系中微生物群落結構和功能的復雜性，任何單一方法都無法全面闡明堆肥體系中的微生物群落組成和功能的演替規律，因此隨著整合多種高通量方法的多組學技術逐漸興起，通過宏基因組、宏轉錄組、宏蛋白組、宏代謝組等多組學技術可以挖掘畜禽糞便堆肥中微生物物種組成、基因功能、代謝通路、關鍵物質等信息。Antunes等［75］利用宏基因組和宏轉錄組分析了高溫堆肥中的微生物群落結構和動態。多組學研究有助于構建堆肥微生物群落結構、功能及物質轉化的關系，更加全面了解微生物群落和功能演替的生物學機制［76］。

5 結論與展望

好氧堆肥被認為是處理畜禽糞便友好且高效的可持續技術，主要是通過堆肥微生物的生化活動來驅動，因此是一個動態微生物學過程。在堆肥過程中，微生物群落不斷的交替演變，而堆肥原料的不同，這些堆肥微生物的結構組成和群落多樣性也會隨之發生改變。不同微生物群落之間除了相互競爭環境生態位也會根據各自的功能不同來協同進行堆肥物料的降解轉化。目前針對堆肥微生物的研究主要集中于堆肥體系中可培養微生物的分離培養和特定的功能微生物的研究等方面，對于堆肥過程中群落結構的組成和功能及其在堆肥過程中的動態演替還未進行全面系統地闡述。因此探究堆肥過程中微生物的生態學機制有利于深刻理解整個堆肥過程。堆肥物料降解過程中微生物群落間存在多種相互作用的生態關系，明確這些關系有利于全面理解堆肥微生物的生態學機制。通過對堆肥微生物群落和功能的研究，能夠進一步了解堆肥過程中物質的降解及轉化的規律，深入理解堆肥過程中的能量轉化和物質代謝。對于改進以及開發新的堆肥技術提供一定的理論支持。不僅在理論上能夠更深入地認知堆肥體系中微生物群落的生態學過程，而且在實際應用中可以科學指導堆肥工藝的改進與實現堆肥工藝的現代化。

在傳統堆肥的基礎上進一步提升改善堆肥工藝，提高堆肥的效益，減少對環境的污染，如氣流膜堆肥，允許水蒸氣揮發，但阻止雨水進入和臭氣的溢出，減少了氮素損失，提高堆肥的肥效。

基于畜禽糞便堆肥微生物群落的演替，挖掘不同階段驅動堆肥的關鍵微生物，篩選獲得關鍵微生物，發酵后以微生物菌劑的形式再次接種到堆體中，有效促進堆肥的效率，縮短堆肥的時間。

未來研究在關注堆肥微生物組成、分布及動態變化的基礎上，還需要關注畜禽糞便堆肥過程中病原菌、抗生素抗性基因的消減情況，確保堆肥腐熟產品的無害化。

除了對畜禽糞便堆肥過程中微生物群落結構和功能演替的監測，還需要監測堆肥產品堆放、存儲及施用過程中微生物變化及對土壤環境和作物的影響。