基于跨反向剪接位點引物特異性檢測circRNA的PCR方法

孫寶箴 全龍萍 康慧 姚玉新 沈甜 陳衛平 杜遠鵬 高振

（1. 山東農業大學園藝科學與工程學院 山東果蔬優質高效生產協同創新中心 作物生物學國家重點實驗室，泰安 272018；2. 寧夏農林科學院園藝研究所，銀川 750002）

環狀RNA（circRNA）是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）、并以共價鍵形成環形結構的非編碼RNA分子，在生物界中廣泛存在。長期以來，它們被認為是由于異常剪接而形成的副產品，功能潛力很?。?］。隨著研究的不斷深入，植物circRNA的特征和功能逐步被挖掘［2］。通過設計1對跨反向剪接位點兩側的背向引物進行qRT-PCR已被廣泛用于檢測circRNA的表達水平，但使用常規背向引物無法特異地擴增發生可變剪接環化時被包含的circRNA，所以開發一種適用于發生可變剪接環化的circRNA的定量分析方法至關重要。

逆轉錄PCR（RT-PCR）、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）是驗證circRNA并分析其表達量簡便、快速的方法，其關鍵在于引物設計的位置。由于circRNA和線性RNA序列相同，為避免擴增出線性序列，circRNA驗證時需要跨反向剪接位點（backsplice site）兩側設計引物，稱為背向引物（divergent primer），擴增產物包含反向剪接位點。背向引物僅可擴增環化后首尾相接的circRNA，因此，通過背向引物RT-PCR結合Sanger測序檢驗可變剪接位點是驗證植物circRNA存在與否的標準。由于qRTPCR成本低且適于大規模試驗，通過背向引物進行qRT-PCR是目前檢測植物circRNA表達水平最常用的方法。使用背向引物通過RT-PCR和qRT-PCR擴增circRNA的方法在番茄［3］、水稻［4］、枸橘［5］和楊樹［6］中均得到應用。將背向引物中的正向和反向引物設計得彼此接近或者重疊可以用于擴增全長circRNA序列［7］。

可變剪切通常指從一個mRNA前體中通過選擇不同的剪接位點組合方式產生不同的mRNA剪接異構體的過程。circRNA同樣存在可變剪接現象，在擬南芥［8］、番茄［3］、棉花［9］、水稻［4，7］、玉米［10］、枸橘［5］和楊樹［6］等植物中均有報道。circRNA可變剪接可分為2種類型，同一基因產生具備相同剪接位點但轉錄本長度不同的circRNA為可變剪接環化，其中同一基因產生不同反向剪接位點的circRNA為可變反向剪接環化［11］。由于circRNA生信分析軟件主要基于反向剪接位點進行篩選，目前，circRNA可變剪接事件的報道集中在可變反向剪接環化。枸橘558個circRNA共出現143個可變反向剪接環化事件［5］，來源于水稻175個基因的1 356個circRNA共出現486個可變反向剪接環化事件［4］，說明可變反向剪接環化事件具有高頻率性。且已有研究通過背向引物RT-PCR方法在擬南芥［8］、番茄［3］、棉花［9］、水稻［4］和枸橘［5］中成功驗證可變反向剪接環化事件的存在。

截止目前，尚沒有針對植物circRNA發生可變反向剪接環化事件時特異檢測被包含circRNA表達量的研究報道。究其原因，使用常規背向引物對被包含的circRNA進行qRT-PCR定量分析時勢必出現非特異擴增，導致無法準確定量。

本研究對葡萄高可信度circRNA的可變剪接環化事件進行分析，旨在開發一種適用于circRNA可變反向剪接環化事件下被包含circRNA定量分析的引物設計方法，并運用RT-PCR和qRT-PCR驗證了該方法可以提高circRNA發生可變反向剪接環化事件時擴增被包含circRNA的特異性，為circRNA的表達研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為一年生‘巨峰’盆栽葡萄，培養于山東農業大學園藝學院光照培養室。培養基質為土壤∶珍珠巖∶蛭石（1∶1∶1）混合物，培養溫度為28℃，光照強度為2 000-2 400 lx，光照/黑暗時間12 h/12 h。

1.2 方法

1.2.1 circRNA測序數據的獲取 對玫瑰香根、莖、葉、花、果實混合組織進行circRNA測序，使用FIND_CIRC［12］、CIRI［13］和CIRCexplorer［14］3種 工具篩選獲得8 354個獨立的circRNA，取3種算法的交集獲得1 432個高可信度的circRNA［15］，用于分析可變剪接事件。

1.2.2 RNA提取及檢測 取‘巨峰’葡萄根或葉片約0.5 g，液氮研磨，用Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（BSC65S1，博日科技）提取總RNA。取3-5 μL RNA溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA質量。

1.2.3 cDNA第一鏈的合成 按照PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（寶日醫生物技術（北京）有限公司）試劑盒說明書標準步驟進行逆轉錄，所用引物為6堿基隨機引物。逆轉錄獲得的cDNA作為RT-PCR和qRT-PCR的模板。

1.2.4 引物設計標準 設計標準：引物GC含量比為40%-60%，TM值為60-65℃，引物長度為20-30 bp，產物大小為150-250 bp，使用NCBI網站的Primer Blast進行特異性驗證（表1）。改進引物基于手動選擇，盡量滿足引物設計標準（表2）。

表1 RT-PCR與熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers for RT-PCR and qRT-PCR

表2 RT-PCR與熒光定量PCR改進引物Table 2 Improved primers for RT-PCR and qRT-PCR

1.2.5 RT-PCR檢測 RT-PCR反應體系為10 μL Taq Master Mix（E005-02A，Novoprotein）、上下游引物 0.5 μmol/L、模板1 μL，用水補齊至20 μL。擴增程序 為94℃ 90 s；94℃ 20 s，57℃ 20 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃ 5 min。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用柱式DNA膠回收試劑盒（DC301，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進行純化，通過Sanger測序確認反向剪接位點序列。

1.2.6 qRT-PCR檢 測 按 照TB Green? Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（RR820A，TaKaRa Bio）試劑盒說明進行qRT-PCR檢測。反應體系為10 μL SYBR Premix Ex Taq、上下游引物0.5 μmol/L、模板1 μL和滅菌水8 μL。反應程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 10 s，40個循環。溶解曲線程序為起始溫度65℃，每個循環增加0.5℃至95℃。qRT-PCR引物同RT-PCR（表1和表2）。經qRT-PCR擴增后，檢查溶解曲線和擴增曲線，以評估是否為特異性擴增。

2 結果

2.1 葡萄circRNA可變反向剪接環化事件

對前期試驗獲得的1 432個高可信度葡萄circRNA進行分析，結果顯示，這些circRNA共由1 043個基因產生。其中，817個基因只產生一個circRNA，226個基因可發生可變反向剪接環化事件，即產生2個或以上的circRNA，共涉及615個circRNA。根據2個circRNA之間的位置將可變反向剪接環化事件分為并列關系（圖1-a）、交叉關系（圖1-b）和包含關系（圖1-c和圖1-d）。

圖1 circRNA可變反向剪接環化事件Fig. 1 Alternative back-splicing circularization of circRNA

以VIT_201s0010g01480為例，其第7-13個外顯子可以產生6個circRNA，分別為circRNA_0376、circRNA_0379、circRNA_0380、circRNA_0381、circRNA_0382和circRNA_0383（圖2）。circRNA_0380 和circRNA_0383以及circRNA_0379和circRNA_0383 屬于并列關系；circRNA_0380和circRNA_0382屬于交叉關系；circRNA_0380和circRNA_0379、circRNA_0382和circRNA_0383、circRNA_0381和circRNA_0379、circRNA_0381和circRNA_0380、circRNA_0381和circRNA_0382、circRNA_0381和circRNA_0383、circRNA_0376和其余5個circRNA屬于包含和被包含關系。

圖2 VIT_201s0010g01480第7-13個外顯子產生的circRNAFig. 2 circRNA produced by exons 7-13 of VIT_201s0010g01480

理論上，設計背向引物對被包含的circRNA進行RT-PCR和qRT-PCR反應的過程勢必會出現非特異擴增的現象。從1 432個circRNA中選取4組具有包含關系的circRNA進行驗證（圖3和圖4），其中circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044 和circRNA_7086分 別 被circRNA_4364、circRNA_ 6018、circRNA_6045和circRNA_7085包含。

圖3 circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086的RT-PCR結果Fig. 3 RT-PCR results of circRNA_4363, circRNA_6017, circRNA_6044, and circRNA_7086

運用RT-PCR擴增4個被包含的circRNA（circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086）時，出現非特異擴增（圖3），同預期結果一樣。經sanger測序后，發現較小的片段分別 為circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086（圖4），較大的片段分別是包含 它 們 的circRNA（circRNA_4364 circRNA_6018、circRNA_6045和circRNA_7085）。運用qRT-PCR擴增后4個circRNA溶解曲線均呈雙峰（圖5），說明qRT-PCR過程同樣出現了非特異擴增，導致表達量分析結果不可信。

圖4 circRNA反向剪接位點及其附近序列Fig. 4 Back-splicing sites and nearby sequences of circRNA

圖5 circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086的qRT-PCR溶解曲線Fig. 5 qRT-PCR dissolution curve of circRNA_4363, circRNA_6017, circRNA_6044, and circRNA_7086

2.2 改進引物的特異性檢驗

由 于circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_ 6044和circRNA_7086的成熟體序列分別被circRNA_4364 circRNA_6018、circRNA_6045和circRNA_7085完全覆蓋，僅在反向剪接位點處存在差異。基于此，設計引物時可將一端引物3'端跨反向剪接位點3-4個堿基（圖6，表2）。

圖6 改進后的引物設計方法Fig. 6 Improved primer design method

使用改進引物分別對circRNA_4363、circRNA_ 6017、circRNA_6044和circRNA_7086進 行RTPCR，結果顯示，circRNA_4363、circRNA_6017和circRNA_7086擴增產物條帶單一，但circRNA_6044出現了新的非特異性擴增片段（圖7）。檢測qRTPCR溶解曲線發現均呈單峰（圖8），表明使用該引物設計方法可以提高circRNA可變反向剪接環化事件RT-PCR和qRT-PCR的特異性。

圖7 引物改進后circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086的RT-PCR結果Fig. 7 RT-PCR results of circRNA_4363, circRNA_6017, circRNA_6044, and circRNA_7086 after using improved primers

圖8 引物改進后circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086的qRT-PCR溶解曲線Fig. 8 qRT-PCR dissolution curve of circRNA_4363, circRNA_6017, circRNA_6044, and circRNA_7086 after using improved primers

3 討論

circRNA目前已知的主要功能包括miRNA吸附作用、與功能蛋白結合調控細胞功能、轉錄調控和蛋白翻譯等［16］。circRNA來源豐富，可分為外顯子來源的circRNA、內含子來源的circRNA、外顯子-內含子來源的circRNA、基因間區circRNA和反義鏈circRNA。擬南芥、番茄、水稻和葡萄中絕大多數circRNA來源于編碼蛋白質的基因，外顯子類型的circRNA占比例最大。多外顯子circRNA為其發生可變反向剪接環化事件提供了多種可能。高通量測序表明植物circRNA可變反向剪接環化事件廣泛存在，并且響應脅迫［8］，暗示不同circRNA可變反向剪接環化體在逆境等生物學過程中發揮功能。circRNA的表達規律分析是研究其功能的基礎，當circRNA可變反向剪接環化事件發生時，運用PCR擴增的方法無法對被包含的circRNA進行精確定量?；诖吮狙芯刻岢隽艘环N適用于對circRNA可變反向剪接環化事件中被包含circRNA定量分析的引物設計方法，即一端引物的3'端跨反向剪接位點3-4個堿基，本研究以上游引物的3'端跨剪接位點為例。本研究中circRNA_4363、circRNA_6017和circRNA_7086通過應用該引物改良方法解決了circRNA可變反向剪接環化引起的非特異擴增問題。由于改進引物設計方法必須跨剪接位點，無法滿足所有的引物設計原則，在進行PCR擴增時有一定的局限性。例如本實驗中的circRNA_6044，使用上游引物3'端跨剪接位點的方法依然不能獲得特異性條帶，可能是由于引物的特異性不高。在遇到這種情況時，可使用下游引物3'端跨剪接位點進行嘗試。另外，由于circRNA可變剪接環化具備相同的反向剪接位點，本研究引物改進方法無法用于發生可變剪接環化的circRNA的表達分析。因此，circRNA定量分析的方法有待進一步的完善和優化。

另外，該引物設計方法也可用于非可變剪接和可變反向剪接環化事件中并列關系、交叉關系中circRNA的表達量分析，并且跨剪接位點的引物既可以是上游引物也可以是下游引物，為葡萄及其他物種circRNA的表達分析研究提供了新的參考，填補了植物circRNA發生可變反向剪接環化事件時特異檢測被包含circRNA表達量方法的空白。

4 結論

本研究提出了一種適用于葡萄circRNA可變反向剪接環化事件中被包含circRNA表達分析的引物設計改良方法，即一端引物的3'端跨反向剪接位點3-4個堿基。通過應用該引物改良方法提高了circRNA_4363、circRNA_6017和circRNA_7086擴增的特異性，相較于常規的背向引物設計方法，該引物設計改良方法更加適用于circRNA發生可變剪接環化事件時的定量分析，其結果更加準確可靠。