發光核酸適配體的篩選及應用

周子琦 張洋子 蘭欣悅 劉洋兒 朱龍佼 許文濤

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院 食品質量與安全北京實驗室，北京 100083；2. 中國農業大學營養與健康系 食品精準營養與質量控制教育部重點實驗室，北京 100083）

先進的活細胞生物分析手段有助于我們更好地了解生命活動的運作模式、實現細胞內目標物質的原位檢測和成像，對研究細胞代謝有重要意義，同時有助于臨床醫學的發展［1-2］。隨著相關研究的深入，一系列胞內成像技術得到開發，但技術存在的局限性不容忽視［3-5］，例如分子信標法中的反義序列會對活細胞造成致命傷害［6-7］，而常用的蛋白標記方法，如MS2-綠色熒光蛋白融合蛋白（MS2- GFP）系統，則會造成細胞蛋白表達超負荷，且難以直接對目的基因實現精準定位［8］。

核酸發光適配體（LNAs）的研發為活細胞內物質原位分析所面臨的挑戰提供了一種適合而新穎的應對策略，現如今越來越多的LNAs得到開發和優化。LNAs是一類能夠特異性地結合熒光團等小分子物質、誘導和增強其發光的FNAs［7］。與分子信標、熒光蛋白標簽和多拷貝融合蛋白系統相比，LNAs提供了一種快速準確的基因定位方法［9］，甚至一些單拷貝的LNAs在結合熒光團后就能在活細胞中發出清晰明亮的熒光［10］，最強的LNA可以將熒光團等小分子的熒光強度提高3 000倍［11］。在輸出器件的幫助下，它們可以作為細胞內外的優秀生物傳感器，進一步應用于生物分析。本文綜述了LNAs的篩選過程，總結了LNAs系統在生物傳感方面的應用，分析了當前LNAs研究的不足之處，以期能夠拓寬生物傳感研究領域，使LNAs系統成為細胞內外物質成像與檢測的優秀傳感元件。

1 LNAs的獲得

實際上，LNAs就是熒光團等小分子的適配體［12］，因此可以通過配體指數富集的系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）獲得［13-14］。DNA發光適配體（DNA light-up aptamers，DLAs）和RNA發光適配體（RNA light-up aptamers，RLAs）的SELEX條件略有不同 （圖1），應用場景與最適檢測物質也各有偏重，因此對于不同種類的LNAs來說，最適合的就是最佳的篩選方法。

圖1 采用SELEX等技術對LNAs進行體外篩選Fig. 1 In vitro selection of LNAs using SELEX and other techniques

1.1 DNA發光適配體的體外篩選

DLAs主要通過基于靶分子與其LNAs之間親和力的親和層析-SELEX獲得［14］，一般方法有珠基- SELEX、目標結合觸發釋放-SELEX和氧化石墨 烯（graphene oxide，GO）-SELEX［12，15］。前 兩種方法之間最顯著的區別是固相載體上的對象。珠基-SELEX的工作原理是將靶分子修飾到瓊脂糖珠或磁珠上［16-17］，然后與DNA文庫孵育。例如Sando等［18］利用Hoechst衍生物7，通過生物素-鏈霉親和素（streptavidin-biotin）磁珠-SELEX獲得了Hoechst的第一個DLAs：I-1-mini。而在目標結合觸發釋放-SELEX的過程中，DNA文庫與修飾在珠基上的互補序列結合，當序列與靶分子結合時就會被釋放到溶液中，用這種方法，研究者得到了孔雀石 綠（malachite green，MG）［19］、結 晶 紫（crystal violet，CV）［16］、硫黃素T（thioflavine T，ThT）［15］以及小檗堿（berberine，BBR）［20］的LNAs。與前兩種方法相比，GO-SELEX省去了復雜的修飾。由于GO可以吸附無結構的單鏈核酸，文庫就可以與GO結合，在上清液中去除結構化和未結合的序列后，將氧化石墨烯與目標分子混合，使結構化的序列留在上清液中。Islam等［15，21］就用此法篩選得到了ThT的LNA——ThT.2-2。

1.2 RNA發光適配體的體外篩選

與DLAs相比，RLAs可以依靠轉錄在活細胞內大量產出，因此更適合RNA等物質的胞內檢測。在篩選時，不僅需要增加轉錄環節，還需要考慮應用環境。細胞內具有多種酶和離子的復雜環境使得體外篩選獲得的高度特異性RLAs可能無法正常發揮作用，此外其他RNA的競爭性結合還會導致RLAs的錯誤折疊，所以親和力不能作為NALAs的唯一選擇依據，親和層析-SELEX也不是NALAs的最佳選擇方法［11，22-26］。一些新的或聯用的方法可以很好地解決上述問題，熒光激活細胞分選-SELEX（fluorescence activated cell sorting -SELEX，FACSSELEX）是將RNA文庫作為表達載體轉化進大腸桿菌中并誘導大規模轉錄的半活體篩選方法，在培養液中加入靶分子就可以觀察細菌的發光情況（圖1），FACS-SELEX可以將RLAs誘導靶分子的光學特性作為篩選條件，同時確保它們在細胞中仍能夠執行正常的功能，苯胺取代的磺酰羅丹明（aniline-substituted sulforhodamine，ASR）和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）熒光團衍生物DFHBI-1T的LNAs就是通過此方法獲得的［27-28］。微流體輔助的體外分選-SELEX（microfluidic-assisted in vitro compartmentalization -SELEX，μIVC-SELEX）也是一 種新型RLAs篩選方法，該方法與前兩種方法不同的是，它以小液滴為篩選單位，并可以準確地測定每一個單位中LNAs的親和及發光性能，通過控制外部電壓以及微流控面板上的不同管道來引導液滴流動，進而完成分選［10，29］。Ryckelynck等利用該方法對GFP熒光團衍生物的LNAs——Spinach和Broccoli進行了優化，并篩選出了磺酰羅丹明B二聚體 Gemini-561的LNA［10，29-30］。

1.3 LNAs的最佳篩選方法

在一定程度上，檢測需求決定了LNAs篩選方法。目前基于LNAs開發的生物傳感器主要用于細胞內外特定核酸序列、代謝物和小分子毒素的檢測［16，20-21，24，31］。DLAs的應用場景顯然比RLAs更廣闊，可以自如地成為體外檢測設備的基本元件。雖然DNA相比于RNA結構更穩定一些，但是在體外復雜環境中單鏈DNA的結構也不夠穩定，波動的構象會導致靶向效率降低，所以基于目標結合觸發釋放-SELEX的篩選方法更適合DLAs。這是因為該方法保證了單鏈DNA的穩定性，增加了特異性結合的選擇壓力，這種方法與珠基-SELEX相比，可以避免因為染料分子中活性位點較少而結合不強的情況，使DNA庫可以完全與染料分子接觸［12］。

同時，基于RLAs的生物傳感器更傾向用于細胞內物質（RNA和蛋白質）的成像［2，7，11，23，32-34］。篩選手段的選擇需要綜合考慮RLAs的結合特異性、結構和發光穩定性以及細胞毒性。因此，在篩選RLAs時不應局限于一種選擇方法，如FACS-SELEX或μIVC- SELEX。串聯SELEX（這里指的是將幾種篩選方法串聯使用）可以通過增加選擇壓力，盡可能模擬細胞環境，獲得效能更強的RLAs［27，30］。

2 LNAs系統在生物傳感領域的應用

2.1 胞內生物成像應用

LNAs系統的研發和使用均始于細胞。1999年，世界上第一條LNAs誕生在一次生色團輔助激光滅活（chromophore-assisted laser inactivation，CALI）實驗中，為了得到細胞內有功能的目的基因，人們獲得了一條MG的適配體，沒想到它可以增強MG的熒光接近2 360倍；到后來，科學家參透了GFP的結構發現，長肽鏈構成的富氧剛性環境竟為內部熒光團分子的脫氫、發光提供了天然的條件，對于GFP的模仿就開始了，越來越多的LNAs被研發出來，要多適合作為LNAs的熒光團或小分子物質也得到開發與合成，并逐漸取代蛋白標簽、分子信標等手段，廣泛應用于胞內成像領域［10，13，29，35-41］。在長達20年的更新換代中，無論是在意外獲得的MGA，還是取代GFP的菠菜（GFP熒光團DFHBI的LNA，Spinach）［23，42］，它們都提高了細胞內物質成像的準確性和靈敏度。目前，LNAs系統可以在活細胞內對蛋白質和RNA實現原位成像，還可以用于跟蹤部分小分子代謝物。

LNAs可以作為一種穩定的RNA標簽，插入目標RNA的側翼序列實現協同轉錄，在加入相應的靶分子后，實現對胞內RNA的實時成像［4，6，9］。目前，LNAs系統可以用于追蹤毒性RNA，外來病毒RNA中的rRNA、mRNA，三重核酸重復序列等等序列（圖2-A）［34，36，39］，Strack等［34］將Spinach與毒性RNA序列中常見的三核酸重復序列（CGG）60（在此之前該三核酸重復序列并未深入研究過，該三核酸重復序列的轉錄物可以通過積聚在細胞核中造成功能蛋白質的分離，產生細胞毒性，進而造成細胞損傷）連接在一起瞬時轉染COS-7細胞，該方法成功檢測到了（CGG）60序列形成的RNA顆粒，并觀測到隨著細胞分裂該RNA顆粒從分散到聚集的動態變化（圖2-A），為三核酸小分子藥物的研發提供了非常生動直觀的研究基礎；在這之后，Nilaratanakul等［36］將引發脊髓炎的神經元病毒Sindbi病毒的基因組（可產生病毒結構性蛋白）、亞基因組（可產生病毒非結構性蛋白）與搭載了兩個F30支架的兩個西蘭花（GFP熒光團衍生物DFHBI-1T的LNA，Broccoli）結合，并將帶有結合序列的表達盒插入SINV的cDNA克隆中，獲得具有4-28個Broccoli拷貝的病毒重組基因組，該病毒重組基因組成功幫助研究人員觀察到了病毒RNA侵染神經細胞的過程和偏好性。除了研究目標序列的動態追蹤和定位，LNAs甚至可以作為一簇規則間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）元件，完成基因座成像，實現RNA譜系分析和超分辨率成像。值得一提的是，對完整的LNAs序列進行劈裂處理，并將劈裂后的序列連在不同RNA序列上，還可以實現對RNA互作的研究（圖2-D）［43］。

LNAs系統也適用于活細胞內的蛋白成像。可將LNAs與物質特異性適配體或結合序列連接在一起，在細胞內共轉錄，就可以在胞內結合特定物質，在染料分子的存在下可實現細胞內的成像。Jaffrey團隊利用這種方法通過Spinach在體外實現了鏈霉親和素、凝血酶和大腸桿菌MS2衣殼蛋白（MCP）的成和定量檢測，之后該團隊使用MCP -Spinach來成像活細胞中的蛋白質，并完成了對單個細胞內源性蛋白表達變異性的檢測［44］。緊接著在2016年，該團隊使用甲基化修飾的無光版Broccoli開發了一種高通量檢測RNA修飾酶的方法，無光的Broccoli通過結合去甲基化脂肪和肥胖相關蛋白（FTO）或m6A去甲基酶ALKBH5后去甲基化而重新發光，這種方法還可以用來選擇FTO抑制劑（圖2-B）［45］。

此外，LNAs系統還可以用于檢測細胞中的小分子代謝物，如5'-二磷酸腺苷（adenosine 5'-diphosphate，ADP），腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine，SAM）［46-47］，環二鳥苷酸（cyclic di-GMP），環腺苷酸-鳥苷酸（cyclic AMP-GMP）［48］和硫胺素焦磷酸（thiamine 5'-pyrophosphate，TPP）［49］，可以將小分子代謝物的適配體與LNAs結合，通過適配體結合小分子后發生的構象變化，使LNAs形成誘導發光的正確構象實現結合發光。Paige等［46］就是將代謝物適配體與Spinach結合，并通過打開Spinach的DFHBI結合環將兩者連接（圖2-C），該適配體復合物可動態監測活細胞中的ADP和SAM。

圖2 LNAs系統在活細胞內的應用Fig. 2 Application of LNAs system in living cells

2.2 體外生物傳感應用

體外檢測環境簡單可控，背景值比胞內檢測低，這些條件使得LNAs系統在體外檢測中具有更廣闊的應用前景［7］。目前LNAs主要在金屬檢測、適配體核酸支架篩選等工作中發揮重要作用［45，50-51］。

核糖開關是由非翻譯區折疊成的具有特定構象的RNA序列，核糖開關在結合代謝物小分子之后的構象變化可以觸發下游反應，對代謝通路產生影響。由此可知，核糖開關是小分子檢測的最佳選擇。Xu等［50］將Spinach 2與czcD核糖開關結合，創造了一種可以檢測多種二價金屬離子（鐵、錳、鈷、鎳、鋅）的熒光生物傳感器。該核糖開關由一個代謝物識別區域和一個LNA區域組成（圖3-A），當二價金屬離子與識別區域結合時，構象變化導致一個新的莖環結構出現，從而使Spinach 2恢復與熒光團結合并增強發光的能力。這也是第一個可逆的Fe2+響應的基因編碼熒光傳感器。

細胞內復雜的環境會使LNAs無法正確折疊而完成成像工作，核酸支架可以幫助LNAs正確折疊且不被細胞內核酸酶水解。常見的核酸支架例如轉運RNA支架，轉運RNA即tRNA（transfer RNA），序列可折疊成緊密的立體構象，因此具有較高的結構穩定性。tRNA支架在使用時，需要我們將目標序列與tRNA序列連接在一起，實現共轉錄，重組的tRNA可攜帶目標序列免受酶水解帶來的傷害［52］。LNAs系統在凝膠內成像方面的應用將有助于發現RNA支架［51］，總RNA電泳凝膠用熒光團染色，攜帶LNAs的片段發光。該方法可用于檢測tRNA等RNA支架在細胞內的降解情況、開發RNA支架，可以顯著提高LNAs的細胞內穩定性（圖3-B）。此 外，LNAs系統還可以在Northern blot中作為SYBR Gold染料的替代，用已知的LNA作為核酸標簽，之后使用熒光團溶液沖洗凝膠。這種染色方法不僅表現出與SYBR Gold法相同的靈敏度和高亮度，而且還能節約成本。

此外，LNAs系統在無細胞傳感領域也有很大的應用潛力。無細胞傳感器是通過細胞內各種反應的模塊化組裝獲得的一種無需細胞支持即可實現快速檢測的傳感器。研究人員開發了一種基于LNAs系統的、配體誘導的RNA輸出無細胞傳感器（ROSALIND），用于水中污染物的檢測（圖3-C）。該傳感器由RNA聚合酶、變構蛋白轉錄因子和DNA轉錄模板組成，以三路連接二聚體Broccoli和DFHBI-1T作為發光基礎。當環境中存在目標污染物時，污染物結合到轉錄調控因子上，調控因子離開轉錄位點，誘導Broccoli的轉錄，Broccoli與環境中的DFHBI-1T結合產生熒光信號。目前ROSALIND已用于檢測一系列水污染物，包括抗生素、小分子和金屬離子［53］。

圖3 LNAs系統在體外的應用Fig. 3 Application of LNAs system in vitro

3 總結與展望

從一次實驗的意外發現到如今得到充分的開發與使用，LNAs已經走過了20年。與傳統的細胞內成像探針或蛋白質標簽相比，它們具有更穩定的結構和更強的光學特性。一些特定的富G序列會在一定條件下折疊形成高級結構——G四鏈體（G-quadruplex，G4），G4結構本身可以結合染料分子實現非特異性發光，例如小檗堿的非特異性發光［54］，但是作為FNAs的一種［55-56］，LNAs能以比G4更強的親和力與特定靶分子結合［16，31，42，57］。在篩選方面，μIVC-SELEX和FACS-SELEX等具有高選擇壓力的選擇模式可以幫助我們獲得具有高親和力和強光學性質的LNAs系統［10，27］。而在應用方面，LNAs可以直接嵌入靶核酸的側邊位置，在活細胞內實現快速準確的原位檢測［23，58］，也可以與其他適配體或核糖開關聯用，用于體外小分子物質的檢測。

LNAs系統作為一種全新的檢測工具，還面臨著許多挑戰，比如還需進一步探索其互作機制中不明確的部分：（1）篩選方法需優化。LNAs尤其是RLAs，需要在不被核酶降解的情況下，在復雜的體內環境中正確折疊。因此需要不斷更新體內篩選方法。（2）機制未知，相互作用關系不明。熒光激活的機理比較清楚，但LNAs與熒光團之間的相互作用需要繼續研究。（3）未知的細胞毒性。雖然后期研究中使用的熒光團的毒性不如最早的MG，但有必要充分了解它們的毒性。LNAs系統對細胞內RNA和蛋白質的影響尚不清楚。（4）應用廣度不夠。LNAs系統在胞內的研究較多，很少在體外和組織層面進行應用。解決上述問題將有助于開發更優的LNAs系統。

隨著研究的深入與技術的進步，LNAs與靶分子的互作機制能夠更加透明，應用將逐步從胞內轉移到胞外，LNAs將會成為傳感研究最有力的工具之一。