堆肥腐殖化過程及微生物驅動機制

王宇蘊 趙兵 馬麗婷 李蘭 鄧亞琴 徐智

（云南農業大學資源與環境學院，昆明 650201）

目前，隨著中國人口的快速增長和經濟水平的提高，農業廢棄物以每年5%-10%的速度上升［1］，年產量高達50億t［2］。其中秸稈年產量約9億t，未利用的約3億t［3］；畜禽糞污產量為38億t，其綜合利用率卻不到60%［4］；蔬菜廢棄物（尾菜）達到約5 億t，未利用比例超過90%。由于農業廢棄物產量巨大，處理工藝一直是研究的重點，填埋和焚燒作為傳統處理工藝，在導致營養物質流失的同時，對環境及人體健康產生了嚴重的負面影響。堆肥由于其工藝相對簡單，投資及運行費用相對較低，逐漸發展完善成為農業廢棄物處理的主要技術手 段［5-6］，微生物（細菌、真菌、放線菌）是其發酵的核心，能夠將農業廢棄物轉化成為腐殖質（HS）等高附加值產品［7-10］。

利用好氧堆肥，微生物可以將有機物料分解為CO2、熱量、生物質及HS等［11-13］。農業廢棄物因來源、氣候條件及產地等不同而性質各異［14］，尤其秸稈類廢棄物因其高有機質特性成為了堆肥理想物料［15］。雖然高半纖維素、纖維素和木質素形成不易被微生物降解的復雜結構［16］，但木質纖維素的分解有利于堆肥過程的HS形成［17-18］。HS作為堆肥最重要的產物，在改良土壤的同時，也是評價好氧堆肥過程最重要的指標之一［19］，其中堆肥腐殖化過程是HS大量聚合的關鍵時期［20］，主要發生在堆肥的降溫階段，真菌在此過程中起主導作用的同時，也可能是堆肥腐殖化過程木質素分解和HS聚合的主要驅動因子［21-23］。因此，研究堆肥腐殖化過程及微生物驅動機制對農業廢棄物資源化處理具有重要的理論及現實意義。

目前，大量研究者將木質素類廢棄物利用好氧堆肥工藝進行了堆肥化處理，研究堆肥過程中微生物群落結構演替、關鍵酶活、前體物質濃度變化等，并進一步分析堆肥腐殖化進程及微生物驅動機制，提出今后堆肥腐殖化過程研究的重要方向，以期為促進堆肥腐殖化過程，強化農業廢棄物資源化利用提供科學參考。

1 堆肥腐殖化過程

堆肥腐殖化過程涉及一個復雜的微生物主導的生物和生化過程，其中腐殖酸的形成過程被稱之為腐殖化。簡單來說，堆肥腐殖化是由一系列不同微生物同時作用以降解有機物產生腐殖酸為目的，其中酶催化是堆肥過程中的驅動因素［24］。在好氧堆肥過程中，升溫和高溫階段中嗜熱微生物占主導地位，首先將纖維素和半纖維素分解形成碳水化合物，在降溫期和腐熟階段，隨著纖維素和半纖維素含量的減少，木質素開始被嗜溫性微生物（真菌）通過分泌木質素酶的形式分解形成酚和醌等物質，然后形成HA［25-28］，因此木質素被稱之為HS形成的原料和骨架。此外，由于HS通常由難以彼此分離的不同分子組成，因此很難完全闡明其結構，根據pH溶解度，HS可細分為富里酸（FA）、腐殖酸（HA）和胡敏素（HM）。根據含氧官能團的大小順序為FA、HA和HS，而聚合物結構的大小順序則相 反［29-30］。分子量較高的HA具有更多的芳香碳，分子量較低的FA則具有更多的脂肪族碳和羧基［31-32］，堆肥腐殖化過程是一個FA含量降低，HA含量升高的過程，在此過程中木質纖維素的降解有助于HA的形成［27，33］，其中降解酶扮演著重要的角色。

1.1 木質素的降解

木質素作為一種可再生的天然芳香族高分子聚合物，主要由苯丙烷醇及其衍生物通過醚鍵和碳鍵連接而形成聚酚類三維網狀高分子化合物，因其復雜的結構難以被微生物降解［34］。真菌作為降解木質素最有力的微生物，因對溫度特殊的喜好，在好氧堆肥過程中大量存在于冷卻及腐熟期，此外由于木質素在升溫期和高溫階段不能完全被分解，因此降溫階段木質素的降解對腐殖化進程顯得尤為重要。

真菌對木質素的降解主要通過其分泌的木質素酶來起作用，包括木質素過氧化物酶（LiP）、錳過氧化物酶（MnP）、漆酶（Lac）等。LiP能夠催化堆肥過程中各種芳香族有機化合物酚（愈瘡木酚、香草酸醇、兒茶酚、丁香酸）和非酚性木質素的分解［35］，形成苯氧自由基等，這些自由基通過與酚類化合物聚合、側鏈裂解、去甲基化、C-C裂解和芳香環開環的偶聯反應，催化木質素中的非酚類芳香底物和β-o-4醚鍵和Cα-Cβ鍵的裂解［36］，LiP主要由擔子菌和子囊菌門等真菌（白腐菌、褐腐菌）分泌［37］。MnP和LiP不僅表現出協同效應，因具有較高的氧化還原電位，對木質素具有獨特降解作用。MnP由Mn2+和血紅素基構成活性中心，Mn2+的作用是傳遞電子，H2O2作為電子受體，接受Mn2+的一個電子，Mn3+與草酸鹽和乙酸鹽等小分子鰲合，從而促進木質素被氧化，然后去甲基化，烷基苯基鍵斷裂，Cα-Cβ鍵斷裂最終實現木質素降解［35，37-38］。MnP大多來自擔子菌門中的P. chrysosporium、P. radiata 和 Rigidoporus lignosus，此外，在白腐菌中MnP的表達比LiP更普遍［39］。Lac作為一種含銅的多酚氧化酶，是一種糖基化蛋白質，可以通過氧化各種底物，包括酚類、芳胺類、苯胺類、硫醇類和木質素，將分子氧的電子還原成兩個水分子。此外，Lac的氧化反應也會導致自由基的形成，自由基作為酶的中間底物，能夠與具有高氧化還原電位的各種底物相互作用，從而增強解聚反應，初始自由基通常是不穩定的，并在酚類化合物氧化系統中從酚轉化為醌，對HS的形成起重要作用［35］。主要存在于Trametes versicolor、P. placenta、H. jecorin和Xylaria sp.等 真菌中。真菌能氧化酚類化合物，生成苯氧自由基和醌類化合物，與軟腐菌相比，白腐菌和褐腐菌的木質素降解率較高［40］。在好氧堆肥腐殖化過程中，木質素降解以后以酚、醛等前體形式與蛋白質進行縮合形成腐殖質。

1.2 HS前體物質的形成

在好氧堆肥腐殖化過程中，來源廣泛的有機成分被微生物降解為小分子產物，小分子產物可通過微生物細胞內代謝生成中間體作為HS形成重要的前體物質，這些前體物質通過特定途徑聚合形成HS［41］，此外關于腐殖化過程中HS形成的美拉德反應、木質素-蛋白質理論和多酚-蛋白縮合理論等都一定程度上強調了前體相互作用對HS形成的重要性［42］，因此在腐殖化過程中前體物質對HS的形成具有重要的作用。

在好氧堆肥過程中，HS前體的形成來源于微生物對木質纖維素的分解，前體物質的產生主要發生在升溫和高溫階段，而HS的聚合則主要發生在降溫和腐熟階段［25］。前體的形成可分為分解和合成兩個部分，大部分有機物首先被微生物分解，然后通過低分子量化合物（如多酚、羧基和氨基酸等）的生化途徑形成HS前體，隨后前體物質形成 HS［26-28］。研究發現，由不同類型多糖組成的纖維素和半纖維素能夠被微生物分解為單糖等，而作為聚酚類三維網狀高分子化合物的木質素則能夠被微生物轉化為更小的芳香物質，這些較小的分子物質一部分可以被微生物用作營養物質，另一部分形成醌類、芳香醛類、醇類、開環產物、多酚或酚類衍生物（羥基醌與氨基酸）等前體物質，進一步形成 HS［41，43-44］。主要作用機理是木質素分解產生的多酚或酚類衍生物與氨基酸等蛋白質發生反應，一部分首先形成腐殖酸分子核心，另一部分通過聚合形成FA，FA再進一步縮合形成HA，最后形成HS，進一步說明木質素及其降解產物對腐殖化進程的重要作用［45］。

1.3 堆肥腐殖質形成的主要影響因素

在堆肥腐殖化過程中，木質素的降解與微生物的代謝和降解酶離不開關系，然而由于微生物在不同的代謝環境中，具有不同的適應性，適宜的環境能夠激發真菌豐度，提高關鍵酶活性來深化木質素降解，強化堆肥腐殖化進程，其中溫度、pH等環境因素是影響腐殖化進程的關鍵環境因子［41，46-50］。

HS作為堆肥的主要產物，其芳香部分被認為來自木質素，而木質素難以降解的特性使得其在高溫期不能完全被分解，真菌對木質素的降解效果遠遠高于細菌和放線菌，并且高溫期的溫度不能滿足真菌菌群的有效生長，此外，木質素降解酶最佳活性和對木質素最大降解速率所適宜的溫度均不能超過45℃，說明溫度對腐殖化進程的重要性。堆肥是一個趨堿的過程［51］，且大部分降解酶所適宜的pH為中性偏酸［38，40］，此外堆肥pH值的高低也會影響微生物的活性以及代謝，一些真菌不能抵抗極端環境條件（高溫和pH）。研究發現，調節堆肥初始pH值對堆肥過程中微生物群落結構有顯著影響［52］，在堆肥過程中所涉及的微生物都是在特定的pH范圍內代謝并繁殖，其中細菌適宜pH 在6-7.5，大多數真菌喜歡酸性條件，并且一些真菌生長環境pH值不宜超過7.5［11］，因此調節或控制腐殖化階段適宜的pH來提高微生物豐度及降解酶的活性，從而促進堆肥腐殖化進程可能是提高堆肥腐質化進程的重要途徑之一［52］。

2 堆肥腐殖化微生物（真菌）驅動機制

真菌對于木質素的降解能力顯著高于細菌和放線菌，由于高溫階段特殊的溫度環境抑制了真菌的繁殖與代謝，恰恰降溫階段的環境為真菌繁殖代謝提供了溫床，這就有助于進一步深化木質素分解，產生更多的前體物質（氨基酸、糖類、酚類、羧酸等）以合成HA，結合HA在降溫及腐熟階段大量生成，因此，推測真菌群落的演替可能是HA合成的一個主要驅動因素。微生物驅動腐殖質的形成與酶密切相關，雖然Lac能夠催化酚類化合物的單電子氧化成自由基中間體，這些中間體隨后可以通過共價鍵相互偶聯，加速腐殖化過程，從而參與HA的形成［53］。此外，也有研究通過在固體廢棄物堆肥中接種漆酶發現，腐殖化速率得到顯著提高［54］，但合成HA的具體機理機制有待進一步研究。

研究發現高木質纖維素廢棄物堆肥腐殖化過程中真菌以子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）為主［24，55-56］，其中子囊菌門中的木霉屬、曲霉屬和裸節菌屬，擔子菌門中的鬼傘屬和平革菌屬等真菌是堆肥腐殖化過程中的主要菌屬［24，57-59］。擔子菌門中的白腐真菌對木質素的降解具有特殊的能力，接種白腐真菌可以促進木質纖維素的生物降解和HA的形成，從而促進腐殖化過程［60］。P. chrysosporium作為擔子菌門的一種，對木質素具有極強的降解作用，在降溫階段接種是保證P. chrysosporium活性的有效方法，其中在堆肥降溫期接種P. chrysosporium是促進纖維素和木質素降解，促進堆肥腐殖化的重要手段［21，52，61-62］。Tortosa等［63］通過對橄欖廢棄物堆肥研究發現，真菌多樣性的增加以子囊菌們（Ascomycota）為主，此外堆肥過程中真菌豐度的增加，也進一步證實了真菌在腐熟階段的重要作用，其中部分擔子菌在腐殖化過程中呈上升趨勢，并且與腐殖化參數呈顯著正相關。

提高腐殖化過程中真菌群落的豐度，特別是增加子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）是促進腐殖化進程的有效方法。在前體物質轉化為HS的過程中，提高關鍵真菌的豐度，深化木質素的降解以提高前體物質對促進堆肥腐質化過程至關重要，這也是目前研究清楚的堆肥腐殖化微生物（真菌）驅動機制。

3 結論與展望

本文綜述了堆肥腐殖化過程中木質素酶降解機制及真菌的驅動作用，在好氧堆肥中掌握腐殖化進程中的微生物群落演替，是深化堆肥腐殖化進程中木質素降解，強化HS形成的關鍵步驟。木質纖維素類生物質好氧堆肥過程中，在腐殖化階段以子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）為主的真菌，包括木霉屬、曲霉屬、裸節菌屬，鬼傘屬和平革菌屬等通過大量分泌木質纖維素關鍵降解酶（LiP、MnP和Lac等）進一步深化木質素的持續降解，以提高HS前體物質的補充是強化堆肥腐殖化進程的主要作用機理。但目前對堆肥腐殖化過程的腐殖質合成途徑和關鍵驅動因子研究較少，探索堆肥過程中參與HS合成代謝途徑的關鍵基因和酶，鑒定功能微生物特性以提高微生物產酶能力，并確定微生物在堆肥過程中的具體功能和作用，以強化腐殖化進程并提高堆肥產物HS含量，是今后堆肥腐殖化過程研究的重要方向。