BioFirst實(shí)時(shí)雙溫微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)在口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料中微生物快速檢驗(yàn)的研究

章金宇 賈紹強(qiáng) 郭 莉 劉 燕 琚童霞 余思宜 楊蘇成

(云南白藥集團(tuán)股份有限公司 中國(guó) 云南 昆明 650200)

BioFirst實(shí)時(shí)微生物雙溫快速檢測(cè)系統(tǒng)是一款使用制備好的即用型檢測(cè)管和基于Windows的分析軟件控制的快速檢測(cè)微生物代謝活動(dòng)的可控溫光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)。其原理是基于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)理論、最新的二氧化碳傳感技術(shù)及染色技術(shù)、新光源和光傳感器來完成對(duì)微生物的檢測(cè)。目標(biāo)微生物在檢測(cè)管中培養(yǎng)基的生長(zhǎng)和測(cè)定可通過感光試劑進(jìn)行檢測(cè)(色彩和熒光染色)。當(dāng)代謝過程發(fā)生時(shí)，該試劑的光譜模式發(fā)生改變，光傳感器檢測(cè)到這些變化，以預(yù)先設(shè)定好的時(shí)間間隔進(jìn)行監(jiān)控[1]。

對(duì)口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料進(jìn)行微生物檢驗(yàn)，可以防止使用被微生物污染的原料進(jìn)行生產(chǎn)，有效避免造成更大的損失，確保產(chǎn)品的微生物質(zhì)量符合國(guó)家、市場(chǎng)以及公司內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)的要求。隨著新技術(shù)新方法的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了較多新型、先進(jìn)、簡(jiǎn)便的微生物快速檢測(cè)技術(shù)，可以明顯縮短微生物檢測(cè)的時(shí)間[2～4]。口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料面臨用量大，周轉(zhuǎn)要求快，時(shí)間緊的局面，引入準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)手段, 在保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提下，有效縮短口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料微生物檢驗(yàn)時(shí)間，滿足快速精準(zhǔn)放行需求，提高原料使用周轉(zhuǎn)效率，有效減少倉儲(chǔ)使用面積，提高資金的使用效率。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)五種不同類型的口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料，采用BioFirst實(shí)時(shí)雙溫微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)與《2015版化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[5]對(duì)原料中的菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，并對(duì)其有效性進(jìn)行評(píng)估。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

BioFirst實(shí)時(shí)微生物雙溫快速檢測(cè)系統(tǒng)(圖1)，菌落總數(shù)檢測(cè)管，霉菌和酵母菌數(shù)檢測(cè)管，耐熱大腸菌群檢測(cè)管，銅綠假單胞菌檢測(cè)管，銅綠假單胞菌添加劑，金黃色葡萄球菌檢測(cè)管，金黃色葡萄球菌添加劑，均為上海美凱純生物科技有限公司；培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，電子天平，高壓蒸汽滅菌器，冰箱，生化培養(yǎng)箱，生物安全柜，定量菌種，渦旋振蕩器，移液器等。

圖1 BioFirst實(shí)時(shí)雙溫微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

二氧化硅、維生素E乙酸酯、山梨醇、月桂醇聚醚硫酸銨(AESA)、蛇床子提取物。

1.3 菌種選擇

銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希氏菌[CMCC(B)44102)、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉(ATCC16404)、枯草芽孢桿菌(ATCC6633)，均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司定量菌種。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 菌懸液的制備

2.1.1 菌落總數(shù)菌懸液制備：按照定量菌株說明書制備大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌混合液濃度約10-102CFU/mL和102-103CFU/mL的菌懸液。

2.1.2 霉菌和酵母菌菌懸液制備：按照定量菌株說明書制備黑曲霉和白色念珠菌混合液濃度約為10-102CFU/mL和102-103CFU/mL的菌懸液。

2.1.3 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌菌懸液制備：按照定量菌株說明書分別制備銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌濃度約1-10CFU/mL的菌懸液。

2.2 樣品稀釋液的制備

2.2.1 二氧化硅、山梨醇、月桂醇聚醚硫酸銨(AESA)、蛇床子提取物：稱取樣品10g，加到裝有玻璃珠及90ml滅菌生理鹽水的樣品瓶中,充分振蕩混勻，靜置15min。用其上清液作為1∶10的稀釋液。

2.2.2 維生素E乙酸酯：稱取樣品10g，加入70g滅菌生理鹽水, 再分別加入10ml滅菌液體石蠟和10ml滅菌吐溫80，置勻漿杯中,10000-20000轉(zhuǎn)勻漿1-3分鐘使成1∶10的稀釋液。

2.3 菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 BioFirst限定值檢測(cè)法介紹：BioFirst實(shí)時(shí)微生物雙溫快速檢測(cè)系統(tǒng)能夠檢測(cè)檢測(cè)管中一個(gè)活的細(xì)菌或者霉菌酵母菌。基于此原理，將樣品按產(chǎn)品放行的限量選擇合適的稀釋度稀釋后接種到BioFirst檢測(cè)管中，根據(jù)檢測(cè)管的陽性變化來判斷原始樣品是否合格的檢測(cè)方法稱為限定值檢測(cè)法。限量值法結(jié)果判讀：如果按照限量稀釋，在機(jī)器運(yùn)行過程出現(xiàn)DT(檢測(cè)時(shí)間)，則表明樣品中的菌含量大于限定值；儀器未檢出(無DT)，則表明樣品中菌含量小于限定值。

2.3.2 取1∶10的稀釋液(2.2制備)按樣品限量值(企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn))做進(jìn)一步稀釋；

2.3.3 菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)加菌及檢測(cè)：將樣品稀釋液分裝到空試管中，每個(gè)試管中分裝9mL樣品稀釋液，再分別加入1mL10～102CFU/mL和102～103CFU/mL的菌落總數(shù)菌懸液、霉菌和酵母菌菌懸液(2.1中制備)，使樣品稀釋液菌的最終濃度為1～10CFU/mL和10～100CFU/mL；再從10～102CFU/mL和102～103CFU/mL的菌懸液中取1mL加入到9ml生理鹽水管中制成濃度為1～10CFU/mL和10～100CFU/mL的純菌液；將未加菌樣品稀釋液、加菌樣品稀釋液和純菌液分別混合均勻后，分別取1mL加入菌落總數(shù)檢測(cè)管、霉菌和酵母菌數(shù)檢測(cè)管內(nèi)，菌落總數(shù)檢測(cè)管37℃上機(jī)檢測(cè)，霉菌和酵母菌數(shù)檢測(cè)管28℃上機(jī)檢測(cè)；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測(cè)法同步進(jìn)行檢測(cè)，以9mL的滅菌生理鹽水為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1、圖2及表1。

圖2 維生素E乙酸酯霉菌和酵母菌快速檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)及曲線

圖3 AESA菌落總數(shù)快速檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)及曲線

表1 菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，截取部分快速檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)及曲線

2.4 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、耐熱大腸菌群實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1 BioFirst有和無定性檢測(cè)法：對(duì)于要求包括致病菌在內(nèi)的一些微生物不得檢出的樣品，需要進(jìn)行定性檢測(cè)。即先將樣品在適合的培養(yǎng)基中進(jìn)行前増菌，然后將增菌液樣品接種到特異性的BioFirst檢測(cè)管中，根據(jù)檢測(cè)管的陰陽性變化來判斷樣品中是否存在有目標(biāo)微生物。結(jié)果報(bào)告：機(jī)器運(yùn)行過程中，如果出現(xiàn)DT檢測(cè)時(shí)間，則進(jìn)行陽性確認(rèn)；儀器未檢出(無DT)，則報(bào)告為陰性。

2.4.2 耐熱大腸菌群加菌及檢測(cè)：分別取1∶10的稀釋液(2.2制備)10mL加至兩瓶90mL的乳糖膽鹽增菌培養(yǎng)基，其中一瓶加入濃度為1～10CFU/mL的耐熱大腸菌群菌懸液1mL，兩瓶于44.5℃下增菌18～24h。混合均勻后每瓶取1mL分別加入到耐熱大腸菌群檢測(cè)管內(nèi)，45℃上機(jī)檢測(cè)；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測(cè)法同步進(jìn)行檢測(cè)，以10mL的滅菌生理鹽水為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.4.3 銅綠假單胞菌加菌及檢測(cè)：分別取1∶10的稀釋液(2.2制備)10mL加至兩瓶90mL的SCDLP液體培養(yǎng)基中，其中一瓶加入濃度為1～10CFU/mL的銅綠假單胞菌懸液1mL，兩瓶于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。混合均勻后取每瓶増菌后的樣液0.1mL分別加入到銅綠假單胞菌檢測(cè)管，另加0.1mL銅綠假單胞菌添加劑，混勻后上機(jī)37℃檢測(cè)；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測(cè)法同步進(jìn)行檢測(cè)，以10mL的滅菌生理鹽水為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4、圖5及表2。

圖4 維生素E乙酸酯銅綠假單胞菌快速檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)及曲線

圖5 AESA耐熱大腸菌群快速檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)及曲線

2.4.4 金黃色葡萄球菌加菌及檢測(cè)：分別取1∶10的稀釋液(2.2制備)10mL加至90mL的SCDLP液體培養(yǎng)基中，其中一瓶加入濃度為1～10CFU/mL的金黃色葡萄球菌懸液1mL，兩瓶于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。混合均勻后取每瓶増菌后的樣液0.5mL分別加入到金黃色葡萄球菌檢測(cè)管，另加0.2mL金黃色葡萄球菌添加劑，混勻后上機(jī)37℃檢測(cè)；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測(cè)法同步進(jìn)行檢測(cè)，以10mL的滅菌生理鹽水為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，截取部分快速檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)及曲線

3 結(jié)論

從BioFirst實(shí)時(shí)微生物雙溫快速檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果和2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測(cè)法的檢測(cè)結(jié)果得出，5種口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料中的菌落總數(shù)、霉菌酵母菌、耐熱大腸菌群、金葡菌和銅綠假單胞菌含量均符合微生物標(biāo)準(zhǔn)。在加菌樣品中，快速檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)菌落總數(shù)和霉菌酵母菌的個(gè)位數(shù)的菌均能檢出，菌落總數(shù)中對(duì)個(gè)位數(shù)菌的檢出時(shí)間在12個(gè)小時(shí)左右，對(duì)十位數(shù)菌的檢出時(shí)間在10小時(shí)左右，對(duì)低至1個(gè)的霉菌酵母菌能夠在40小時(shí)左右檢出，對(duì)十位數(shù)的霉菌酵母菌的檢出時(shí)間約為25小時(shí)。對(duì)加到樣品中極少的(每g樣品中添加0～10個(gè)菌)耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均能夠檢出，增菌后的樣品能夠在3小時(shí)內(nèi)快速檢出，在10小時(shí)內(nèi)完全確定陰性結(jié)果。

2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》對(duì)微生物的檢測(cè)方法中，對(duì)菌落總數(shù)的檢測(cè)需要2天，霉菌和酵母菌數(shù)的檢測(cè)需要5天，耐熱大腸菌群和銅綠假單胞菌的檢測(cè)需要2～3天，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)需要約3～5天。BioFirst實(shí)時(shí)微生物雙溫快速檢測(cè)系統(tǒng)能夠在18小時(shí)內(nèi)完全確定樣品中菌落總數(shù)的陰性結(jié)果，在48小時(shí)內(nèi)確定霉菌酵母菌的陰性結(jié)果，在30小時(shí)內(nèi)確定耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的陰性結(jié)果，與2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測(cè)法相比大大減少檢測(cè)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)證明，BioFirst實(shí)時(shí)微生物雙溫快速檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)準(zhǔn)確、快速、與2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》結(jié)果基本一致。對(duì)于化妝品原料中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌檢測(cè)項(xiàng)目的適用性良好，能夠作為口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料快速檢測(cè)和放行的可靠方法，有利于口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料在獲得準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果下的快速放行和質(zhì)量管理人員的科學(xué)決策。

2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》方法與BioFirst實(shí)時(shí)微生物雙溫快速檢測(cè)系統(tǒng)方法確定陰性檢驗(yàn)時(shí)間對(duì)比如圖6。

圖6

因?yàn)榭谇蛔o(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料很多，每個(gè)原料的性質(zhì)和微生物的限量都不一樣，對(duì)微生物的影響也都有不同。而現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)過程中，因?yàn)闄z測(cè)項(xiàng)目和檢測(cè)內(nèi)容過多，所以后續(xù)還需要繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而將各種原料的限定菌量和檢測(cè)時(shí)間對(duì)應(yīng)起來，從而確定各原料具體的陰性確定時(shí)間，有利于原料的精準(zhǔn)放行，快速使用。

參考文獻(xiàn)(略)