不同基因型的香蕉葉片結構與褐緣灰斑病發生的相關性研究

殷曉敏 連子豪 劉永霞 王麗霞 陳弟 何應對

（中國熱帶農業科學院海口實驗站/海南省香蕉遺傳改良重點實驗室 海南海口 571101）

香蕉是芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（MusaL.）單子葉植物，脈序為橫出平行脈，側脈與中脈近乎垂直，而側脈之間近于平行，該葉片類型有利于病原菌的侵入與擴展蔓延，使得香蕉褐緣灰斑病（Sigatoka diasease of banana）成為一種常發性重要病害[1]，并且在全球范圍內流行危害[2]，其病原致病菌為香蕉生球腔菌（Mycosphaerella musicolaJ. L. Mulder.）[2]。香蕉在抽穗期間至少要保存有7～8片青綠無病的功能葉片，在采收時仍保存有4～5片功能葉片，才能獲得預期的產量和保證的果實質量[3]。在海南5—10月高溫多雨季節病害盛發，受害葉片面積常占葉片總面積的20%～60%，造成產量大減、果實品質下降，嚴重時減產50%以上，同時造成農藥使用量劇增，環境污染加劇[3]。

香蕉的完全葉片由葉鞘、葉柄和葉片組成，葉片內部組織結構組成為表皮，葉肉和葉脈，葉肉組織由柵欄組織和海綿組織組成。在表皮細胞覆有角質層和氣孔，氣孔以一定間隔散布于整個葉片，表皮氣孔是氣體交換與水分蒸騰的主要通道，同時也是植物病原菌侵染植物的重要通道。關于葉片氣孔密度、氣孔形態特征與病害抗性關系在臍橙[4-5]、柑橘[6]、桉樹[7]、楊樹[8]、大豆[9]、蠶豆[10]、黃瓜[11]等作物上有相關報道。關于葉片組織結構與抗病性關系在蘋果[12]、獼猴桃[13]、木薯[14]、桉樹[15]、油桐[16]、大豆[17]、向日葵[18]、苦瓜[19]等作物上開展過相關的研究。各報道得出植物對病原菌的抗性取決于葉片氣孔的多少及解剖結構，但是氣孔與抗病性之間的關系，不同作物和不同病害的研究之間結論各異，無關或密切相關[20]。鑒于不同基因型香蕉受葉斑病危害程度不同，而對于香蕉氣孔、葉片組織結構與病害發生的相關性尚未見報道，本研究以不同基因型香蕉種類為研究對象，通過葉片氣孔和形態學結構特征的比較，分析其與病情指數的相關性，以期尋找抗性鑒定初選指標，為篩選抗病品種（系）節約時間和成本，為選育優質抗病新型香蕉品種（系）提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

于2021年5月在海南省儋州市寶島新村紅洋隊基地（N 19°53′30″，E 110°04′52″）開展試驗。土壤質地為磚紅壤土，pH 4.40，有機質14.4 g/kg，全氮0.053%，全磷929.91 mg/kg，全鉀3.29%，堿解氮156.60 mg/kg，有效磷200.10 mg/kg，速效鉀332 mg/kg。氣候條件為熱帶濕潤季風氣候，年平均氣溫為23.5℃，光熱充足年，年均光照時數在2 100 h以上。雨量適中，年均降雨量1 800 mm，5—10月為雨季，占年雨量的80%，為香蕉褐緣灰斑病高發病期。

以貢蕉（Musaspp.，AA）的海貢蕉、HKXJ-1品種（系），香芽蕉（Musa acuminataL. Cavendish subgroup，AAA）的巴西蕉、紅香蕉品種，大蕉（Musa paradisiacaL.，AAB）的東莞中把大蕉、東莞高把大蕉品種，粉蕉（Musaspp. PisangAwak subgroup，ABB）的廣粉1號、西貢蕉品種，共計4種基因型8個品種（系）為供試材料，其中，HKXJ-1為香蕉供試品系，其余7個為香蕉供試品種。

香蕉褐緣灰斑病致病菌香蕉生球腔菌（Mycosphaerella musicolaJ. L. Mulder.）為本課題組田間自然分離保存。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 在香蕉抽蕾期，以不同的品種（系）設定8個區組試驗，每小區隨機調查20株，單株為試驗重復，每株從頂葉向下調查10片葉，以香蕉褐緣灰斑病菌噴霧接種侵染為田間鑒定對象，記錄調查的總葉片數、病葉數及病級，統計

發病率，計算病情指數[21]。病情分級標準為[22]0級，無病斑；1級，病斑面積占整葉面積的5%以下；3級，病斑面積占整葉面積的6%～15%；5級,病斑面積占整葉面積的16%～25%；7級，病斑面積占整葉面積的26%～50%；9級，病斑面積占整葉面積的50%以上。

1.2.2 組織觀察 葉片氣孔形態和氣孔密度的觀察和測定 在香蕉抽蕾期，取材方向盡量一致，從上至下第3個葉片，3次重復。采用 IAA 固定液固定后置于冰醋酸與過氧化氫各半的離析液中離析24～48 h，離析后分上、下表皮制片觀察。氣孔密度為在正置顯微鏡（NI/E）10倍鏡下14～16個視野氣孔數之和的每視野平均數[10]。計算葉片背面和腹面氣孔密度，測定氣孔長度、寬度及保衛細胞長度、寬度。

葉片組織結構的觀察和測定 用滅菌刀片切取大小為3 mm×6 mm葉片組織塊，用鑷子將其放入裝有清水的培養皿中，作為切片材料備用；采用改進后的徒手切片法[23]，利用手搖式冷凍超薄切片機（CM1950）將試驗材料置于冰臺上進行切片。在正置顯微鏡（NI/E）下觀察葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、背部和腹部表皮厚度及角質層厚度。

1.2.3 數據分析 利用Excel 2010軟件進行數據統計分析，SPSS 23.0軟件進行方差多重比較分析，以及病情指數與氣孔密度、組織結構的相關性分析[9,12]。

2 結果與分析

2.1 香蕉葉片組織結構形態學觀察

2.1.1 氣孔形態學的觀察 氣孔是氣體交換與水分蒸騰的主要通道，也是植物病原菌侵染植物的重要通道。從橫切片來看，氣孔以一定間隔分散于葉片腹部表皮和背部表皮，是由兩個半月形保衛細胞構成，保衛細胞在氣孔兩側中央膨脹。不同品種的病情指數、背部氣孔密度（個/mm2）、腹部氣孔密度（個/mm2）、氣孔長度（μm）、氣孔寬度（μm）和保衛細胞寬度（μm）差異顯著（表1）。其中病情指數較低的是紅香蕉和廣粉1號，分別為7.05和8.09，較為抗病；其次是HKXJ-1和西貢蕉，病情指數分別是12.15和13.43，較為耐病。病情指數較高的為東莞高把大蕉和巴西蕉，分別是30.97和31.32，較為感病。病情指數越低抗病性越強，抗病性從高到底依次為紅香蕉>廣粉1號>HKXJ-1>西貢蕉>東莞中把大蕉>海貢蕉>東莞高把大蕉>巴西蕉。葉片背部氣孔密度最大是紅香蕉，為328.45個/mm2，其次是HKXJ-1，為298.93個/mm2，再次是東莞中把大蕉和巴西蕉，分別為203.51和114.23個/mm2。葉片腹部氣孔密度最大是紅香蕉，為98.75個/mm2；其次為西貢蕉和HKXJ-1，分別為72.88和70.37個/mm2；再次為東莞中把大蕉，為12.00個/mm2。氣孔寬度最大是HKXJ-1，為16.56 μm；其次為紅香蕉和東莞中把大蕉，分別為15.87和15.74 μm；最小是東莞高把大蕉，為13.46 μm。保衛細胞寬度最大是西貢蕉，為33.49 μm；其次是HKXJ-1和海貢蕉，分別為31.58和30.75 μm；最小在紅香蕉，為24.67 μm。

表1 香蕉不同品種的葉片氣孔形態學指標

2.1.2 葉片組織結構的測定 不同品種葉肉組織間的葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度差異顯著（表2）。在葉片背部一側有海綿組織，為數層球狀或不規則的細胞稀疏連接，細胞間隙充分發達，在外部與氣孔相通，呼吸時進行氣體交換。海綿組織厚度最大值在廣粉1號，為268.97 μm；其次是HKXJ-1和紅香蕉，分別為236.53和223.41 μm；最小在巴西蕉，為134.14 μm。在葉片腹面一側具有柵欄組織，為1層細胞，表面呈直角柱狀細胞，彼此稍微緊密相連，細胞間隙比較狹小，葉片柵欄組織細胞發達，能夠擴大細胞表面積，擴大與陽光及空氣接觸面積，其光合作用效能也越大。柵欄組織厚度最大值廣粉1號，為63.82 μm；其次在西貢蕉東莞中把大蕉和HKXJ-1，分別為48.54和40.49 μm；最小在海貢蕉，為19.39 μm。葉片厚度最大是紅香蕉，為359.57 μm；其次為廣粉1號和HKXJ-1；分別為303.5和294.07 μm；最小在西貢蕉，為215.79 μm。

表2 香蕉不同品種的葉片組織結構學指標

2.2 香蕉葉片結構形態學與病情指數的相關性分析

2.2.1 氣孔形態與病情指數相關性分析 用SPSS 23.0對病情指數、葉片氣孔形態各項指標進行相關分析，得出各數據間的相關系數矩陣（表3）.結果表明，病情指數與氣孔密度、氣孔形態各項指標的相關程度依次為背面氣孔密度>腹面氣孔密度>氣孔寬度>保衛細胞寬度>氣孔長度>保衛細胞長度。其中，氣孔各形態指標間存在極顯著正相關，氣孔長度與保衛細胞長度、氣孔寬度的相關系數分別為0.567和0.412。病情指數與氣孔長度、氣孔寬度、保衛細胞長度和保衛細胞寬度相關性不顯著，而病情指數與葉片背面氣孔密度、腹面氣孔密度呈極顯著負相關，相關系數分別為–0.874和–0.757。另外，背面氣孔密度和腹面氣孔密度間呈極顯著正相關，相關系數為0.891，表明同一品種背面氣孔密度越多，腹面氣孔密度隨之增加，表明葉片氣孔密度越大，病情指數越低，抗病性越強。葉片腹面氣孔密度、背面氣孔密度可作為香蕉種質抗病性鑒定的初選指標。結合植株病情指數鑒定結果得出，紅香蕉抗病性最強，廣粉1號次之，巴西蕉抗病性最弱，抗病性順序依次為紅香蕉>廣粉1號>HKXJ-13>西貢蕉>東莞中把大蕉>海貢蕉>東莞高把大蕉>巴西蕉。

表3 香蕉葉片氣孔形態與病情指數的相關性

2.2.2 組織結構與病情指數相關性分析 用SPSS 23.0對病情指數、葉片組織結構各項指標進行相關性分析，得出各數據間的相關系數矩陣（表4）。結果表明，病情指數與葉片組織結構各項指標的相關程度依次為海綿組織厚度>葉片厚度>柵欄組織厚度>背部皮層厚度>腹部皮層厚度>角質層厚度。其中病情指數與柵欄組織厚度、背部皮層厚度、腹部皮層厚度、角質層厚度相關性不顯著，而與葉片厚度、海綿組織厚度呈極顯著負相關，相關系數分別為–0.544和–0.591。另外，葉片厚度與海綿組織厚度間呈極顯著正相關，相關系數為0.550，表明海綿組織厚度和葉片厚度數值越高，病情指數越低，抗病性越強。因此抗病性最強分別為廣粉1號、HKXJ-1及紅香蕉。葉片厚度和海綿組織厚度也可作為香蕉種質抗病性鑒定的輔助參考指標。

表4 香蕉葉片組織結構與病情指數的相關性

3 討論與結論

3.1 討論

香蕉葉片扁平、薄而寬，由葉片、葉柄和葉鞘組成完全葉，葉片長達2 m以上，為巨大葉型，有地下莖長出的葉鞘，形成彼此重疊的地上莖。氣孔以一定間隔散布于整個葉片，一般是50～300個/mm2[24]。本研究發現，不同香蕉基因型葉片腹部氣孔密度為12～98個/mm2，背部氣孔密度為114～328個/mm2（表1），表明不同基因型香蕉種類葉片氣孔密度分布均較多，這一研究結果與旱地和濕地植物氣孔分布較少，中生植物氣孔分布較多的報道相一致[24]。關于氣孔密度與植物抗病性的相關性，許多學者持有不同的觀點。楊樹對黑斑病的抗病性[8]和華山松對皰銹病的抗病性研究[25]認為，氣孔密度與抗病性不存在相關性。有研究結果指出，氣孔密度與抗病性呈負相關，如大豆對灰斑病抗性[9]、蠶豆對銹病抗病[10]和黃瓜對霜霉病抗[11]，表明抗病品種提供菌絲從氣孔侵入的機會少，也是抗病品種抵抗病菌侵入的第一結構屏障。也有研究表明，獼猴桃葉片氣孔密度與潰瘍病抗性成正相關[13]，這一研究結果與本研究結果一致，葉片氣孔密度與不同基因型香蕉種類抗病性呈正相關，即氣孔密度越大，病情指數越低，抗病性越強。不同基因型香蕉種類病原菌侵染位置有所不同，香蕉背部氣孔密度顯著多于腹部表皮氣孔密度，其背部氣孔密度大優點在于既利于減少葉片蒸騰作用，又利于氣體交換，這與蠶豆、桉樹葉片氣孔密度分布特點一致[7，10]，也契合了關于香蕉褐緣灰斑病在葉片病斑腹面產孢豐盛的報道[3]。

葉斑病潛育期較長（1～2月），最長的可達115 d，較老的葉片不容易受到侵染，第3片或第4片葉上看到的病痕，其實是它們剛展開時受到侵染的結果[3]。有報道指出，病原菌直接穿透寄主組織時，角質層起到增強抗病性的作用[14]。本研究指出，葉片角質層厚度與抗病性相關性不顯著，與木薯[14]的研究結果相一致；但海綿組織厚度與抗病性相關性不顯著，與木薯對細菌性枯萎病抗性[14]的研究結果不同。本研究結果表明，葉片厚度與海綿組織厚度相關性極顯著，因此，葉肉組織結構與香蕉葉片葉斑病抗性的關系有待進一步研究。

本研究以不同基因型香蕉種類為研究對象，通過葉片結構特征比較，分析其與香蕉葉斑病抗病相關性。葉片背部氣孔密度增加，病情指數降低，抗病性增強。葉片海綿組織厚度和葉片厚度數值越高，病情指數越低，抗病性越強。綜上所述，結合病情指數田間鑒定結果，香蕉抗病性鑒定順序依次為紅香蕉>廣粉1號>HKXJ-1>西貢蕉>東莞中把大蕉>海貢蕉>東莞高把大蕉>巴西蕉。

3.2 結論

不同基因型香蕉葉片結構特征存在著抗葉斑病的差異，葉片腹面氣孔密度、背面氣孔密度可作為葉斑病抗性的初步鑒定參考標準，葉片厚度、海綿組織厚度可作為抗病性鑒定的輔助參考指標，為高抗品種的引種栽培，以及選育優質抗病新型香蕉品種（系）提供依據，同時將為篩選抗病品種節約大量的時間和成本。