番茄果皮顏色的基因功能標記開發及色差儀參數相關分析

蔡錦玲 姚文 陳品品 藍波妙 林濤

（泉州市農業科學研究所 福建泉州 362200）

野生番茄經過幾百年的馴化已成為受世人喜愛的經濟蔬菜之一[1]。番茄果實顏色是重要的外觀品質性狀之一，果實越紅其營養品質越好，在鮮食或加工方面更受市場的歡迎[2]。果實顏色由果皮和果肉顏色共同作用，其中果肉顏色受多基因控制，而果皮顏色的分子遺傳機制相對簡單，但目前針對番茄果皮顏色開發分子標記和精準測量及分類方法的報道仍然較少，不利于果皮顏色分子選擇育種工作的開展。開發新的基因功能標記并使用色差儀快速精準地測量果皮顏色，為番茄果皮顏色的分子標記輔助選擇育種提供技術支持，對加快番茄果實色澤的選育進程具有重要意義。

番茄果實顏色豐富，有紅色、粉色、黃色、綠色、紫色和橙色等[3]。果肉顏色受多個基因的控制，在類胡蘿卜素和花青素代謝途徑中，因r、nor、Gr、Cnr、Nr、hp、t、Del、Aft、atv、Abg等的突變或滲入使得番茄果實呈現出多種顏色[4-6]。番茄果皮顏色相對簡單和易于分組，一般可分為有色和無色透明果皮2種，有色果皮對無色果皮呈顯性作用，受基因SIMYB12控制[7-8]，在果實發育過程中，因SIMYB12基因無法表達而不能在果皮中積累類黃酮，從而使成熟果實的果皮為無色透明，但果皮無色透明的番茄風味和口感更好。當SIMYB12基因正常表達時，成熟果實的果皮表現為有色，更耐儲藏和運輸。

果皮顏色的鑒定主要有直觀鑒定法或儀器測定法。直觀鑒定法，是經典且使用方便、基礎簡單的測色方法，僅適用易于分類顏色的分級工作，但植物種皮顏色變異范圍極為廣泛，多呈連續性分布，直觀鑒定法易受人為因素的影響，容易忽略一些中間的過渡色[9]，不利于顏色的精確測量、分類和量化分析，儀器測定法是指通過運用儀器（通常是色差儀）將顏色轉為精準的數值，使顏色數值化、具體化和可視化，操作簡單、耗時短，能夠對顏色實現更精準的測量和分類[10]。目前色差儀在許多作物的果皮顏色或者果色測量上均有應用，如在櫻桃番茄[11]、黃瓜[12]和辣椒[13-14]等的應用。

由于生活品質的提高，市場上對無色透明果皮紅色果肉的粉果番茄需求不斷增加，而目前應用于番茄果皮顏色的功能標記及精準測量的研究相對較少。祝光濤[15]研究發現，在粉果番茄SIMYB12基因起始密碼子上游4 kbp處存在大小為603 bp的序列缺失，會影響基因的結構和功能，對果皮顏色造成一定的影響。因此，本研究就該位點設計與番茄果皮顏色相對應的分子功能標記，并利用30份不同類型的番茄種質資源進行驗證；對色差儀的Lab和Ch測量值與果皮顏色相關性進行分析，快速準確地區分不同果色番茄的果皮顏色，探索不同果皮顏色的分類閾值。雖然SIMYB12基因不同單倍型對果皮顏色的影響已有報道[15-16]，但通過設計分子功能標記對不同的大果番茄和櫻桃番茄種質資源進行鑒定和利用尚未見報道。本研究基于SIMYB12基因上對果皮顏色有影響的缺失位點，開發可用于瓊脂糖電泳并且重復性好的分子功能標記，并利用色差儀實現快速準確的果皮顏色分類，為番茄果皮顏色的分子輔助選擇育種和表型鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材 選擇泉州市農業科學研究所收集的30份番茄種質資源為供試材料，包括櫻桃番茄28份（其中黃色櫻桃番茄3份、紫色櫻桃番茄2份、紅色櫻桃番茄23份）和紅色大果番茄2份，命名從編號P1～P30，果型和果實顏色如圖1所示。

圖1 三十份番茄種質資源的果型和顏色

1.1.2 試劑和儀器 分子實驗試劑耗材均購自北京索萊寶科技有限公司；分子功能標記引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；INFINITE 200 PRO酶標儀為Tecan公司生產；水平電泳儀、Universal Hood PCR儀、GelDoc凝膠成像系統為BIO-RAD公司生產；色差儀為漢潽公司生產的HP-C220精密色差儀。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及濃度測試 參照Saghai- Maroof等[17]方法，采用CTAB法提取番茄幼葉基因組總DNA。DNA的濃度使用酶標儀進行測試。根據測定結果，添加TE使得各試驗材料的DNA濃度在50～100 ng/μL。

1.2.2 果皮顏色SIMYB12基因分子功能標記設計 祝光濤[15]基于番茄參考基因組SL2.40版本的研究結果顯示，番茄果皮顏色基因SIMYB12在1號染色體的SL2.40ch01: 70 935 936-70 938 394 bp上，在其上游4 kbp的位置上存在著603 bp的缺失。目前番茄參考基因組已更新到SL4.0版本，依據SIMYB12基因的最新注釋信息，從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網站下載番茄的最新組裝基因組，通過序列比對確定該基因和缺失片段的位置，并提取基因及其上下游10 kbp的序列區域（SL4.0ch01: 71 312 725-71 326 073 bp），用Oligo 7軟件（http://www.oligo.net/downloads.html）于缺失603 bp的兩側適當位置進行引物設計，設計擴增產物的大小滿足于在瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測；接著將設計完成的引物在NCBI上與番茄的全基因組進行Primer-Blast比對，確定引物的特異性，篩選合格的引物交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增及電泳檢測 PCR反應體系（15 μL）：模板DNA 1 μL，10×buffer 1.5 μL,dNTPs 0.6 μL，前后引物各0.6 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，ddH2O 10.4 μL。反應在艾本德Universal Hood PCR儀上進行。

PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58.6℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環；最后72℃延伸10 min。反應結束后4℃保存。為了確定不同引物最適合的退火溫度，不同引物PCR退火溫度均依據梯度結果進行調整，梯度溫度范圍為43～59℃。

瓊脂糖凝膠電泳：DNA擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠添加1%的gel red核酸染料進行電泳，置于伯樂GelDoc凝膠成像系統下觀察并拍照。統計各樣本的擴增條帶，大片段帶型記為1，小片段帶型記為3，雜合帶型記為2，缺失數據記為0。

1.2.4 果皮顏色色差儀測量 隨機選擇充分成熟番茄果實，沿果面赤道一周均勻取3個點，用色差儀測得L、a、b、C和h的數值后取平均值。每份材料測定3個果實，每個果實重復測定3次。色差儀的5個測量值具有不同的涵義：L代表黑白通道，0表示黑色，100表示白色。a代表紅綠通道，a>0表示顏色偏紅，a<0表示顏色偏綠。b代表黃藍通道，b>0表示顏色偏黃，b<0表示顏色偏藍。C值反映色彩飽和度或純粹度，色度越大，顏色越鮮艷；h值為色調角，反映紅綠藍3個基本色及其之間的過渡顏色，0°表示純紅色，120°表示純綠色，240°表示純藍色。

1.2.5 數據統計分析 數據的整理、分析和圖形繪制采用開源工具R（4.0.2，https://www.r-project.org/）完成。

2 結果與分析

2.1 供試樣品DNA質量檢測

使用酶標儀對提取的番茄種質DNA進行快速檢測，結果（表1）表明，樣品濃度OD260nm/OD280nm范圍在1.81～1.99，比值小于1.9的樣品10份，比值大于1.9的樣品20份，平均值為1.92，可見供試的30份番茄種質DNA提取質量均滿足后續常規PCR擴增。

表1 三十份供試番茄種質資源DNA的質量

2.2 功能標記的設計及驗證

從NCBI網站下載最新的番茄基因組DNA序列，通過序列比對定位缺失的603 bp位置(圖2)。利用Oligo 7設計引物，基于基因SIMYB12上游缺失序列的區域設計的產物擴增片段大小在200～2 000 bp，該標記適合在瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，并且經Oligo 7軟件檢驗可知，其無發夾、引物二聚體等次級結構，所以設計的引物理論可行。

圖2 缺失位置及A-10功能標記的序列信息

本研究基于SIMYB12基因共設計了16對引物（表2）：3對引物（A-2、A-3和A-7）的擴增產物未包括缺失的序列，擴增產物的片段大小無差異，不可用于區分缺失的位點；有5對引物（A-8、A-9、A-11、A-12和A-13）位于缺失內，可單顯性擴增出缺失序列，為顯性標記引物，除A-13擴增片段大、效果較差，其他均能準確地判斷出果皮是否有色，但無色透明果皮和缺失數據無法區分；有8對（A-1、A-4、A-5、A-6、A-10、A-14、A-15和A-16）跨越缺失區域的引物，其中4對引物（A-5、A-6、A-15和A-16）擴增產物偏大、效果較差，另外4對引物（A-1、A-4、A-10和A-14）可以共顯性標記出缺失和非缺失2種基因型。由于缺失區域的GC含量偏低（A-10產物的GC含量為23%），導致PCR擴增困難，常規的反應體系和退火溫度在該區域經常無法擴增。利用P1（千禧，無色果皮）、P9（夏日陽光，純合有色果皮）、P5（F1雜合，有色果皮）3個材料作為功能標記測試的供試材料，通過不同的退火溫度測試4對共顯性標記，A-10的擴增效果最好，最適合的退火溫度為58.6℃，最終選取A-10作為SIMYB12基因的分子功能標記（圖3）。

表2 分子功能標記的編號及序列信息

圖3 引物A-10不同退火溫度電泳結果

2.3 番茄種質資源的分子鑒定

利用A-10分子功能標記對30份種質資源進行基因型鑒定（圖4）。結果表明，30份番茄種質資源中有18份（P1-P4、P10、P13、P16、P18、P19、P21-25、P27-P30）擴增出約287 bp的特異性條帶，為純合隱性的缺失基因型，分子鑒定其果皮為無色透明果皮；3份材料（P9、P17和P20）擴增出約890 bp的條帶，為純合顯性基因型，分子鑒定其果皮為有色果皮；還有9份（P5～P8，P11～P12，P14～P15，P26）同時擴增出287和890 bp的條帶，說明控制果皮顏色的基因位點處于雜合的狀態，為雜合基因型，分子鑒定為有色果皮。

圖4 供試番茄材料A-10分子功能標記電泳檢測

2.4 果皮顏色測定及分析

利用色差儀采集30份番茄種質資源果實顏色的數據，獲得L、a、b、C和h測量值。Lab和LCh代表2個顏色空間，可以相互轉化。通過對果皮顏色在這兩個顏色空間進行分析，最終使用三維坐標對Lab進行分析（圖5-A），將b≥45的果分類為有色果皮，b＜45的果歸類為透明果皮；Ch值采用二維坐標分析（圖5-B），將色彩飽和度C≥60的分類為有色果皮，2種數據分析方法歸類結果一致。通過色差儀可以快速測出不同果皮顏色的測量值，并且使用Ch測量值即可區分大部分果皮的顏色。

圖5 三十份種質資源的果皮顏色分析

2.5 功能標記與目測法和儀器測試法的相關性分析

供試的材料中（表3），通過目測鑒定法，共有無色透明果皮18份，有色果皮12份；依據分子功能標記的鑒定，隱性純合的無色透明果皮材料18份，有色果皮12份，其中顯性純合材料3份，雜合材料9份；依據Ch測量值，色差儀鑒定法鑒定的透明無色果皮20份，有色果皮10份。分子功能標記的基因型與目測法的果皮顏色完全相符（相符率：100 %），分子功能標記的基因型與Ch鑒定法鑒定的果皮顏色相符的有28份（相符率93.3%），不相符的2份（6.67%），不相符的材料為P7和P8。P7和P8為紫色番茄，在SIMYB12基因的缺失位點上為雜合型，果皮為有色果皮，但由于花青素含量高，呈現紫黑色，故色差儀測得其顏色飽和度C值及黃綠色b值較低。

表3 三十份番茄種質資源分子鑒定法與目測鑒定法和儀器鑒定法的比較分析

3 討論與結論

在SIMYB12基因上游區域存在著影響功能的603 bp缺失序列[15-16]，是設計InDel分子功能標記的理想區域。王仁漢等[18]參照祝光濤[15]設計的InDel分子標記，對32份普通番茄材料進行驗證，有2份無法擴增，并且對16份櫻桃番茄進行檢測，其準確率為62.5%。筆者在使用該InDel標記時，也容易出現無法擴增的情況。經過序列分析，PCR反應無法擴增是該缺失區域的GC含量偏低所導致。因此，本研究的主要目的是在該位點重新設計新的分子功能標記，并優化其PCR反應體系，以期提高其檢出率和準確性。該缺失區域的GC含量偏低，約為23%，PCR產物擴增較難，本研究設計的A-10分子功能標記，最初利用15 μL常規的反應體系也經常出現材料無法擴增的情形，后通過增加dNTPs的濃度到0.6μL，并嘗試調整不同的退火溫度。在使用退火溫度53℃時，雖然其結果的正確率提高到66.7%，但由于退火溫度較低，容易出現較多的副帶，產生假陽性的雜合帶型。最后通過調整退火溫度為58.6℃，使A-10分子功能標記檢測準確性提高到100%，解決缺失區域擴增困難的問題。

紫色番茄P7和P8由于受到花青素代謝途徑合成基因的影響，花青素在其果皮上的積累，因此果實顏色呈現出紫色[19]。除了紫色番茄果皮顏色的分子檢測與色差儀采集數據存在不一致的情況外，其它顏色的番茄檢測結果均相符。本試驗供試的2份紫色番茄材料的果皮為有色果皮，但色差儀的Lab或者Ch測量值均在無色透明果皮的標定范圍內，是花青素使果實呈現紫色[20]，紫色為紅色色相，導致色差儀顯示其b值偏向紅色；測量值小于45，或C值小于60，判斷為無色。在紫色番茄果皮顏色的測量中，色差儀的有色和無色果皮的閾值范圍，可使用有色果皮與無色果皮的紫色番茄材料作進一步的測定和分類。但因目前本課題組收集的紫色番茄種質資源僅有有色果皮的材料，故不能完成這部分對比試驗。因此，對于紫色番茄的果皮顏色測定分類僅能通過傳統的目測鑒定法來完成。

傳統的番茄果皮顏色一般通過目測法簡單進行區分和歸類，但是果皮顏色變異范圍極為廣泛，多呈連續性分布，直觀鑒定法易受人為因素的影響，不利于顏色的精確測量和分類，容易忽略一些中間的過渡；而儀器測定法中使用的色差儀自帶光源，不易受外界環境條件變化影響，能準確測量有細微差別的2種顏色，而且具有操作便利、無損的特點。通過比較目測法和色差儀鑒定法測定結果與基因型的相符度可知，除了紫色番茄存在基因型與儀器測定法不一致外，其余的供試番茄材料中目測法和儀器測定法測定結果與基因型的檢測結果均一致，表明儀器測定法可用于非紫色番茄的測定，且能夠更精準地測定不同果皮的顏色并進行歸類。由于SIMYB12基因存在著多個突變的位點，不同的單倍型對果皮顏色的影響不盡相同，本研究僅在603 bp缺失位點開發的功能標記A-10雖不能完全代表不同的果皮顏色，但可用于大部分種質資源的鑒定。因此，在針對番茄果皮顏色的分子標記輔助育種方面，本研究結果具有一定的參考價值。