聚已亞甲基鹽酸對重組蛋白A 溶液的抑菌作用研究

張海珍,楊文俊,楊正根

（廣州康盛生物科技股份有限公司，廣東 廣州，510660）

金黃色葡萄球菌蛋白A 能與人類及多種哺乳動物血清中免疫球蛋白分子的Fc 段特異性結合，在抗體純化用親和層析介質［1,2］及醫學領域均有廣泛的應用［1］。為防止蛋白A 溶液在冷藏或常溫儲存過程中可能發生的微生物污染、延長保存時間，需要在保存液中加入抑菌劑。聚已亞甲基鹽酸（PHMB）是目前公認的較安全的抑菌劑［3］，對細菌和真菌的殺滅效果均較好［4-5］,被廣泛用于新型抑菌材料的研發［6-8］。本文對PHMB 不同濃度及不同時間處理后，重組蛋白A 溶液中的菌數下降情況進行比較研究，以期為同類重組蛋白制品中抑菌劑的選擇提供參考。

一、材料與方法

（一）材料與儀器

大 腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44102〕、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B）26003〕、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B) 10104〕、白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F）98001〕及黑曲霉(Aspergillus niger)〔CMCC（F）98003〕均為購買自中國藥品生物制品檢定所的標準菌株，菌數傳代為第二代。胰蛋白胨大豆肉湯（瓊脂）培養基、沙氏葡萄糖（瓊脂）培養基、氯化鈉-蛋白胨緩沖液為廣東環凱微生物科技有限公司生產。PHMB（20%）購自廣州市拓瑞化工科技有限公司；BCA 試劑盒購自Thermo 公司；瓊脂糖購自GE公司；高碘酸鈉購自天津福晨化學試劑廠；重組蛋白A 溶液、人IgG 溶液、PBS 溶液、洗脫溶液由本實驗室制備。

實驗儀器有ZQWY-200N 型臥式恒溫振蕩器（上海知楚儀器有限公司）、UV-2600 型紫外分光光度計（日本島津）和LRHS-205F-11 恒濕恒溫培養箱（上海龍躍儀器設備有限公司）。

（二）實驗方法

1.菌液的制備

將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌甘油菌接種至20 ml 胰酪大豆胨液體培養基中，35 ℃培養24 h，離心收集菌體，然后用0.9 %無菌氯化鈉溶液稀釋并制成108cfu/ml 的菌懸液。白色念珠菌甘油菌接種至20 ml 沙氏葡萄糖液體培養基中，25 ℃培養48 h，離心收集菌體，然后用0.9 %無菌氯化鈉溶液稀釋并制成108cfu/ml 的菌懸液。黑曲霉接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養基，25 ℃培養5～7 d，然后用含0.05 %聚山梨酯80 的0.9 %無菌氯化鈉溶液將表面的孢子洗脫，制成108cfu/ml 的孢子懸液。各菌株的菌懸液同時用平皿法作活菌計數。

2.供試液的制備

取廣州康盛生物科技有限公司生產的無菌無熱原的重組蛋白A 溶液，用無菌生理鹽水稀釋至終濃度約5 mg/ml，分裝至儲液瓶中，然后加入PHMB溶液。

3.計數方法驗證

采用培養基稀釋法消除供試液的抑菌活性。分別加入相應溶液于無菌平皿后，立即傾入溫度不超過 45 ℃的瓊脂培養基，混勻凝固，倒置培養，每株試驗菌平行制備2 個平皿，按平皿法測定其菌數。細菌使用胰蛋白胨大豆瓊脂培養基，35 ℃培養24 h；真菌使用沙氏葡萄糖瓊脂培養基,其中白色念珠菌25 ℃培養48 h，黑曲霉25 ℃培養5～7d。

（1）試驗組：取制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使供試液中含菌量不大于100 cfu/ml。

（2）供試品對照組：取制備好的供試液，以生理鹽水代替菌液同試驗組操作。

（3）菌液對照組：以生理鹽水替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值應不小于菌液對照組菌落數值的50%。

4.抑菌效力測定

將含PHMB 的供試液分裝于無菌儲液瓶中，每瓶100ml，按接菌量105～106cfu 接入各個菌株的菌懸液或孢子懸液。充分搖勻后，從三角瓶中取出1 ml，用氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋10-3～10-5后倒平板，得到0 時溶液中的初始菌落數。然后放置不同時間后分別從三角瓶中取樣1ml，采取平皿法計數。其中，每個稀釋度2 個重復，計算平均菌落數。2020版中國藥典［9］規定抑菌效力判斷標準見表1，應符合A 的抑菌效力。

表1 抑菌效力測定標準

5.重組蛋白A 溶液穩定性測定

在重組蛋白A 溶液中加入PHMB，使其終濃度為0.15%（1.5 g/L），常溫放置（10～30 ℃）12 個月，分別在0、3、6、9、12 個月取出部分樣品，測定蛋白濃度及蛋白活性以考察蛋白的穩定性。其中，蛋白濃度用BCA 試劑盒進行測定。蛋白活性的測定是將重組蛋白A 偶聯至瓊脂糖Sepharose 6FF 上，評價免疫吸附材料的吸附性能。

吸附劑的合成：取5 ml 瓊脂糖凝膠用50 ml 純化水清洗后與20 ml 濃度為0.05 mol/L 的高碘酸鈉溶液混合置于三角瓶中，30 ℃，150 rpm避光反應3 h，用50 ml 的純化水洗滌；然后加入10 ml 的重組蛋白A 溶液（pH 8.4 的硼酸鹽緩沖液），30 ℃，150 rpm 避光反應4 h，用50 ml的純化水清洗；加入10 ml pH 7.6的磷酸鹽緩沖液及2.5 ml 乙醇胺溶液進行封端，于30 ℃、150 rpm 避光反應1 h；最后分3 次加入0.1 g的硼氫化鈉還原12 h；用50 ml 的純化水清洗即可。

吸附性能的測定采用靜態吸附法：取合成的吸附劑1 ml 于一次性層析柱中，用20 ml 的PBS 溶液平衡后，加入45 mg 的人 IgG 溶液，28 ℃、120 rpm 吸附1 h，然后加入8 ml 洗脫溶液，28 ℃、120 rpm 洗脫15 min，收集洗脫液。用可見紫外分光光度計在200～400 nm 進行圖譜掃描，記錄278 nm 處的吸光度，即OD278。

吸附性能（mg/ml）=（(OD278×V洗脫（ml）×稀釋倍數）/1.38

注：1.38 為IgG 質量濃度標準曲線測定系數。

二、結果與分析

（一）計數方法驗證

通過測定，按照試驗組的菌回收率大于50 %的要求，當PHMB 濃度為0.04 %時，大腸埃希菌至少需要稀釋100 倍才能消除抑菌作用；銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉至少需要稀釋400 倍消除抑菌作用；金黃色葡萄球菌至少需要稀釋1000 倍才能消除抑菌作用。當PHMB 濃度為0.15 %至少需要稀釋1500 倍才能消除抑菌作用（見表2）。

表2 各試驗菌株的最低稀釋倍數

（二）不同濃度的PHMB 抑菌效力測定

PHMB 對細菌的抑菌作用較強，0.04 % 的PHMB 溶液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的抑菌作用均能達到2020 版藥典要求。0.04 %的PHMB 溶液對白色念珠菌的抑菌作用也能達到藥典要求，但是對黑曲霉的抑菌作用較弱，無法達到藥典要求（見表3）。

表3 不同濃度的PHMB 溶液抑菌效力測定

（二）不同濃度的PHMB 溶液對黑曲霉的抑菌作用

因PHMB 對黑曲霉抑菌作用較弱，單獨研究了提高濃度后的抑菌效力。結果表明，當PHMB 濃度提高至0.15%時，對黑曲霉的抑菌效果可以完全滿足2020 版藥典的要求（見表4）。

表4 較高濃度PHMB 對黑曲霉的抑菌作用

（三）蛋白濃度的測定

按照試劑盒說明書測定不同時間所取樣品的蛋白濃度，重組蛋白A 初始濃度為5.04±0.22 mg/ml,放置3 個月后測定蛋白濃度為5.10±0.18 mg/ml,放置6 個月后測定蛋白濃度為4.85±0.11 mg/ml,放置9 個月后測定蛋白濃度為5.11±0.26 mg/ml,放置12個月后測定蛋白濃度為5.12±0.08 mg/ml。放置12個月后，蛋白濃度與初始值相比未下降。用SPSS 9.0軟件進行單樣本T 檢驗，測定第3、6、9、12 個月的樣品與0 個月的樣品差異不顯著（P=0.944），在誤差范圍內認為重組蛋白A 的蛋白濃度未下降（見圖1）。

圖1 不同時間下蛋白濃度的變化

（四）合成免疫吸附劑吸附性能測定

所合成的免疫吸附劑對人IgG 溶液的靜態吸附性能見圖2。合成的吸附劑初始吸附性能為29.06±0.37 mg/ml,放置3 個月后測定吸附性能為29.23±0.20 mg/ml,放置6 個月后測定吸附性能為28.72±0.43 mg/ml,放置9 個月后測定吸附性能為28.39±0.37 mg/ml,放置12 個月后測定吸附性能為28.12±0.59 mg/ml，吸附性能下降了3.23 %。用SPSS 9.0 軟件進行單樣本T 檢驗，測定第3、6、9、12個月的樣品與0 個月的樣品差異不顯著（P=0.159），說明吸附劑的吸附性能未明顯下降，重組蛋白A 的活性下降在可接受范圍內，重組蛋白溶液常溫放置12 個月后穩定性良好。

圖2 不同時間下蛋白活性的變化

三、結論與討論

抑菌劑是指抑制微生物生長的化學物質。中國藥典規定生產企業確定抑菌劑時必須評價抑菌劑的抑菌效力，所有抑菌劑都具有一定的毒性，所以制品中抑菌劑的量應為最低有效劑量［9］。PHMB 殺菌原理是PHMB·HCl 中的胍基有很高的活性，能使聚合物成正電性，很容易被呈負電性的各類細菌、病毒所吸附，從而抑制細菌病毒的分裂功能，使其喪失生殖能力，加上聚合物形成的薄膜堵塞了微生物的呼吸通道，使微生物迅速窒息死亡。PHMB 小鼠急性經口LD50＞5000 mg/kg，屬無毒物質，PHMB 是目前最安全無毒高效的消毒劑［3］。本研究通過測定PHMB 作為蛋白溶液中的抑菌劑的抑菌效果，結果顯示在低有效濃度為1.5 g/L 時能夠完全達到2020版藥典規定的A 類抑菌劑抑菌效力的要求，且對蛋白濃度及蛋白活性影響不大，可以作為蛋白溶液的抑菌劑進行推廣應用。