禽致病性大腸桿菌P型菌毛papA基因克隆與基因分型分析

陳俊紅， 蔡 煜， 戴 薇， 雷衛強， 戴鼎震

(金陵科技學院動物科學與食品工程學院，江蘇南京210046)

禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(APEC)引起的細菌性傳染病，對養禽業危害很大，常可引起氣囊炎、肝周炎、心包炎，甚至敗血癥[1-2]。由于大腸桿菌具有菌毛和毒素等多種致病因子，尤其是菌毛可對宿主上皮細胞進行黏附，有助于大腸桿菌在宿主組織器官的定居和繁殖，從而引發上述病理變化[3-4]。禽大腸桿菌具有1型和P型兩類菌毛，二者均由染色體基因編碼，絕大多數禽致病性大腸桿菌表達1型菌毛[5]。1型菌毛能凝集多種動物的紅細胞，且可被D-甘露糖所抑制，因此，1型菌毛又稱甘露糖敏感血凝特性菌毛(MSHA)。P型菌毛也能凝集紅細胞，但不能被D-甘露糖所抑制，因此又稱之為甘露糖抵抗血凝特性菌毛(MRHA)。1型菌毛主要黏附禽上呼吸道，有助于細菌對宿主呼吸道的初步感染，而P型菌毛主要黏附禽下呼吸道，有助于細菌對宿主呼吸道的深部感染[6-7]。P型菌毛是由papI、papB、papA、papH、papC、papD、papJ、papK、papE、papF及papG等基因構成的基因簇編碼的，PapA和PapG是大腸桿菌P型菌毛的結構蛋白，其中PapA是組成P型菌毛的主要結構蛋白，由1 000多個亞單位通過組合形成螺旋桿狀的菌毛桿；PapG是P型菌毛頂端的黏附蛋白[8-9]。研究結果表明，P型菌毛也存在于感染人尿道上皮的大腸桿菌上，且其papA基因與禽大腸桿菌P型菌毛papA基因存在明顯的同源性，反映了它們起源于同一祖先[10]。但同時，P型菌毛papA基因也處于持續的變異之中，先后出現了14個不同的基因分型，這些基因分型可分別用分型PCR引物進行擴增鑒別，而所有位于5′端的引物是共同的，只是3′端的引物不同[11-13]。然而，即使是同樣的基因分型，其相互之間仍然存在微小的變異[9]。禽大腸桿菌P型菌毛papA基因分型報道較少，目前報道的papA基因多屬于基因11型。但不同分離菌株之間是否存在變異仍有待于通過PCR擴增和測序予以分析，這對分析P菌毛抗原并研制P型菌毛亞單位疫苗非常重要。本研究擬以2株禽致病性大腸桿菌為研究對象，針對其P型菌毛上的papA基因設計、合成相關引物，進行PCR擴增，對擴增產物片段進行酶切、連接、轉化，構建papA基因重組克隆載體。然后對papA基因堿基序列進行測定，并與相關序列進行比較分析，從而推斷 P 型菌毛papA基因是否存在變異以及變異規律，為 P 型菌毛的檢測，相關疫苗的制備提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及主要試劑

禽致病性大腸桿菌TK3菌株(血清型O1)及HJ2菌株(血清型O114)，含有P型菌毛，由金陵科技學院獸醫微生物學實驗室提供。pTG19-T PCR 產物克隆載體來自上海捷瑞生物工程有限公司，膠回收試劑盒購自OMEGA公司，質粒抽提試劑盒由深圳逗點生物技術有限公司提供，瓊脂糖購自蘭杰科技有限公司。

1.2 引物的設計與合成

鑒于禽大腸桿菌P型菌毛papA基因多為11型，因此以papA基因11型PCR分型通用引物為第1對引物(P1、P2)，預計擴增片段大小為281 bp。

P1：5′-GGCAGTGGTGTCTTTTGGTG-3′

P2：5′-GGCCCAGTAAAAGATAATTGAACC-3′

第2對引物(P3、P4)為papA基因兩端相對保守區選擇的引物，預計擴增片段大小為522 bp，位于papA基因堿基序列的第4至第525位堿基之間，不完全包含papA基因全堿基序列。

P3：5′-ATTAAGTCGGTTATTGCCGG-3′

P4：5′-TGCAACTGCTGAGAAGGC-3′

第3對引物(P5、P6)擬用來擴增完整papA基因11型基因，但由于缺少基因11型可參考的模板，需要擴大引物設計的區域。擬以親緣關系相近的其他papA基因堿基序列作為模板。查找文獻發現基因11型(F11)與基因14型(F14)、基因13型(F13)及基因165型(F165)親緣關系相近，同屬于一個進化分支[5]，其中，基因14型具有完整的pap基因堿基序列可供參考。遂以基因14型大腸桿菌83 972株中包含papA基因14型(GenBank：DQ10312.1)的papB至papH之間的堿基序列為模板，分別從papA基因上游的papB基因3′末端及papA基因下游的papH基因5′末端篩選引物，預計擴增片段大小為943 bp，中間片段包含了papA基因的全堿基序列。

P5：5′-ACAGATGAGTCGTCGGCATTTG-3′

P6：5′-GACCGGCAAAAACACCATGAAC-3′

1.3 papA基因DNA模板提取

提取大腸桿菌TK3及HJ2菌株染色體DNA作為模板。取1.5 ml過夜培養菌液，離心后懸于0.5 ml裂解液(TE pH 8.0，0.5% SDS和蛋白酶K50 μg/ml)中，55 ℃水浴1 h后用等體積飽和酚、氯仿及1∶1苯酚和氯仿混合液抽提，乙醇沉淀后溶于蒸餾水中。

1.4 反應體系與反應條件

反應體系均為30 μl：待檢測papA模板3 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl(終濃度均為0.4 μmol/L)，2×PCR Mix 15 μl，滅菌三蒸水10 μl。

反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復性 10 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；最后72 ℃延伸5 min，16 ℃維持5 min。擴增產物均用1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 目的基因和T載體連接、轉化與篩選鑒定

凝膠電泳后切膠：加450 μl溶膠液，65 ℃水浴至完全融解。將溶液轉移到DNA純化柱上,12 000 r/min離心1 min,加600 μl洗液至DNA純化柱中，12 000 r/min離心1 min,重復洗1次。12 000 r/min離心5 min，室溫揮發5 min，除去殘留的乙醇。加20 μl預熱的洗脫液，室溫靜置2 min，最大轉速離心收集。取200 μl PCR管，加1 μl pTG19-T載體，再加3 μl PCR膠回收產物，混勻。加4 μl 酶和Buffer混合的即用型2×預混液，立即混勻。在PCR儀上，25 ℃連接30 min。冰上融化DH5α感受態細胞，加入連接產物，輕彈管壁混勻，冰上靜置30 min，42 ℃熱激45 s后，立即冰上放置3 min，加900 μl LB培養基(不含Amp)，37 ℃搖菌培養1 h(轉速250 rpm)。Amp抗性的LB固體培養基在37 ℃預熱。5 000 r/min離心5 min，棄900 μl LB培養基，用剩余的培養基重懸細菌，用無菌的涂布棒涂菌，37 ℃培養箱中倒置培養過夜。

1.6 PCR鑒定克隆

用T載體上M13上下游引物進行PCR克隆與鑒定。取無菌的2.0 ml離心管，加200 μl LB培養基(含Amp)，用無菌的20 μl槍頭挑取菌落，并在培養基中反復吹打，37 ℃搖菌培養4 h(轉速250 r/min)。反應體系10.0 μl：待檢測papA模板1.0 μl，M13上游引物0.4 μl， M13下游引物0.4 μl(終濃度均為0.4 μmol/L)，2×PCR Mix 5.0 μl，滅菌三蒸水3.2 μl。PCR反應條件為98 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃延伸5 min，16 ℃ 維持5 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7 papA基因堿基序列測定與分析

選取陽性克隆搖菌并抽提質粒：PCR產物凝膠電泳后選取陽性克隆，取60 μl菌液加入到3 ml LB培養基(含Amp)，37 ℃搖菌培養過夜(轉速250 r/min)，用質粒抽提試劑盒抽提質粒。取10 μl質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。通用測序引物:

M13 F：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′

M13 R：5′-AGCGGATAACAATTTCACAGAGGA-3′

通過Snap Gene和DNA-Star等生物分析軟件對測定的基因堿基序列進行分析、比對，鑒定出HJ2及TK3菌株P型菌毛papA基因是否屬于基因11型。將HJ2及TK3菌株P型菌毛papA基因堿基序列進行比對，分析相互之間的同源性。通過模擬翻譯得出HJ2及TK3菌株P型菌毛PapA蛋白的氨基酸序列進行比對，同時與親緣關系相近的基因13型(F13)、基因14型(F14)和F165基因堿基序列及其編碼的氨基酸序列進行對比，分析其同源性及其變異特點。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

以提取的菌種基因組為模板，用引物1從HJ2及TK3模板中均擴增出產物，電泳結果見圖1。從圖1可以看出，電泳泳道1和2均有1條DNA條帶，大小接近300 bp，與預定的281 bp相近。

M:標準DNA對照；1：HJ2；2：TK3；3：陰性對照。圖1 引物1擴增HJ2及TK3菌株基因組papA基因片段電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of amplifying papA gene fragments in HJ2 and TK3 genomes using primer 1

以HJ2和TK3菌株基因組為模板，運用引物2和引物3進行了PCR擴增，結果如圖2和圖3。引物2僅從HJ2菌株基因組中擴增出產物，大小接近522 bp；引物2未能從TK3菌株基因組中擴增出產物。引物3從TK3菌株基因組擴增出產物，大小接近943 bp，但用引物3未能從HJ2菌株基因組中擴增到產物。

M:標準DNA對照；1:HJ2；2:TK3；3:陰性對照。圖2 引物2擴增HJ2及TK3菌株基因組papA基因片段電泳結果Fig.2 Electrophoresis results of amplifying papA gene fragments in HJ2 and TK3 genomes using primer 2

M:標準DNA對照；1:TK3；2:HJ2；3:為陰性對照。圖3 引物3擴增TK3菌株基因組papA基因片段電泳結果Fig.3 Electrophoresis results of amplifying papA gene fragments in TK3 genomes using primer 3

2.2 papA基因克隆與篩選鑒定

PCR擴增產物的連接與轉化：以擴增產物為模板，再次進行PCR擴增，結果在同樣的位置均獲得更粗和更亮的DNA條帶，將含有擴增產物的可溶性膠切塊回收DNA，連接后獲得了待鑒定的重組質粒。以篩選待鑒定的重組質粒為模板，運用M13通用測序引物進行PCR擴增、驗證，篩選到3種擴增產物陽性克隆，PCR所擴增的片段大小與預期的產物相近。以引物1和引物3擴增產物的重組質粒為模板，用M13上下游引物進行PCR擴增，結果見圖4和圖5。

M：標準DNA對照；1～7：陽性條帶；8：陰性對照。圖4 以引物1擴增產物的重組質粒為模板進行PCR鑒定克隆papA基因片段電泳結果Fig.4 The electrophoresis results of the cloned papA gene fragment identified by PCR using the recombinant plasmid of amplified product by primer 1 as the template

M：標準DNA對照；1、3、4：陽性條帶；2：陰性對照。圖5 以引物3擴增產物的重組質粒為模板進行PCR鑒定克隆papA基因片段電泳結果Fig.5 The electrophoresis results of the cloned papA gene fragment identified by PCR using the recombinant plasmid of amplified product by primer 3 as the template

2.3 papA擴增產物測序結果

2.3.1 引物1擴增的產物序列 運用M13通用測序引物對所擴增的所有DNA產物進行序列測定，獲得了不同片段大小的papA基因堿基序列。運用Snap Gene生物軟件分析比對，發現用基因11型擴增引物獲得的HJ2和TK3菌株基因組的擴增產物大小為281 bp，兩者papA片段相似度達99.5%以上，僅1個堿基有差異(圖6)。將HJ2和TK3菌株基因組擴增產物序列與GenBank中已發表的禽大腸桿菌papA基因11型堿基序列(基因序列登記號L07420，含有基因11型)[11]進行比對，發現HJ2菌株的papA基因與比對的papA基因11型區域堿基序列相同，但TK3菌株的papA基因11型有1個堿基發生變異，由A變為C(圖7陰影標注)，說明擴增到APEC菌株HJ2和TK3的papA基因均屬于基因11型。

下劃線表示引物1所在位置，有一處堿基變異，標有陰影，TK3菌株中為C，HJ2菌株中為A。圖6 以引物1從TK3、JI2菌株基因組中擴增出的papA基因片段與基因11型堿基序列比較結果Fig.6 Comparison of the sequence of papA gene fragments amplified from TK3 and JI2 genomes by primer 1 with the sequence of type 11 papA gene

2.3.2 引物2和引物3擴增的產物序列 引物2從HJ2菌株基因組中擴增的產物大小為522 bp，涵蓋從papA基因序列第4位至525位堿基位，有編碼7個氨基酸的堿基序列不在擴增范圍內。引物3擴增的產物大小為943 bp，經堿基序列測定比對發現其包含了papA全部序列(549個bp)，TK3菌株 P型菌毛papA基因共有549個堿基對，其編碼182個氨基酸。

2.4 APEC菌株TK3及HJ2 P型菌毛papA基因變異分析

經比對，菌株TK3、HJ2與F13、F14、F165之間存在一定的同源性，主要表現為papA基因堿基序列的5′，從起始密碼子到基因擴增分型的共同上游引物(圖7中的陰影部分)的堿基序列完全相同，這正是所有基因分型papA擴增可共用同一上游引物的原因。相比之下，不同分型papA基因堿基序列的的3′端堿基序列有著明顯的差異性，由圖8可以看出，不同分型papA基因堿基序列的3′末端近60個堿基差異比較明顯，在可供比較的序列中，至少有6處堿基出現變異，而同為基因11型的禽大腸桿菌TK3與HJ2，在引物2所擴增區域間(圖8陰影處)二者之間有2處堿基不同，這可能正是引物2能夠擴增出HJ2菌株的papA基因片段而不能從TK3菌株擴增出片段的原因。

陰影部分表示基因分型上游通用引物所在區域，方框內為堿基差異部分。圖7 TK3、HJ2菌株papA基因與基因13型(F13)、基因14型(F14)及基因165型(F165) papA基因5′端部分堿基序列同源性比較Fig.7 Homology comparison of papA gene amplified from TK3 and HJ2 strains with type 13 papA gene, type 14 papA gene and type 165 papA gene in 5′ end

○表示未檢測；陰影部分表示引物2下游引物所在區域，方框內為堿基差異部分。圖8 TK3、HJ2與F13及F165 papA基因3′端部分堿基序列同源性比較Fig.8 Homology comparison of papA gene amplified from TK3 and HJ2 strains with type 13 papA gene and type 165 papA gene in 3′ end

2.5 TK3及HJ2菌株PapA蛋白氨基酸變異分析

經檢測分析，TK3與HJ2菌株的papA基因同屬于基因11型，而F165與F11大腸桿菌papA基因的之間的相似度達95.3%[14]，將TK3、HJ2與F165和F11大腸桿菌PapA蛋白氨基酸序列進行比對，結果見圖9。結果顯示PapA蛋白同源性較高，由182個氨基酸組成，相互之間絕大多數氨基酸序列一致，有5處氨基酸變異，分別位于第20、31、107、147、151位，而在TK3菌株和HJ2菌株之間，PapA蛋白僅有3處出現氨基酸變異，位于第20、147、151位(圖9)。TK3菌株和HJ2菌株作為二個不同血清型大腸桿菌，擁有同一基因分型的papA基因，說明papA基因分型與菌體血清型關聯不大。

○表示未檢測；陰影部分表示氨基酸差異部分。圖9 TK3、HJ2與基因型F11及F165菌株PapA蛋白氨基酸序列比較Fig.9 Comparison of the amino acid sequence of PapA protein between TK3, HJ2 and genotype F11 and F165 strains

3 討論

P型菌毛是禽致病性大腸桿菌(APEC)重要的毒力因子，主要起到黏附人和動物宿主細胞的作用，從而有助于細菌的定居繁殖，引發病理變化，甚至造成死亡。不僅人大腸桿菌具有P型菌毛，禽大腸桿菌也有P型菌毛，所不同的是人大腸桿菌菌毛黏附的是尿道上皮細胞，引起尿道感染，而禽大腸桿菌P型菌毛則是與禽類深部呼吸道結合導致感染[1,8-9]。研究結果表明，P型菌毛是APEC的重要毒力標記，其流行分布率雖然不高[9]，但可能還有變異類型未能檢出。國內很少有關于APEC的papA基因克隆與基因分型的報道。目前國外文獻報道的APEC的P型菌毛papA基因均為基因11型，因此，采用基因11型的擴增引物可以檢測出同基因類型的papA基因片段。但基因11型片段僅有281 bp，而完整的papA基因片段為549 bp，該基因片段則位于完整papA基因的第35至314位。因此基因11型擴增引物檢測出的papA基因片段并不能反映完整的papA基因信息。

本研究采用能夠擴增基因11型的引物擴增到兩個菌株的papA部分基因片段。為了弄清APEC的不同分離株P型菌毛完整的papA基因之間的差異性，采用了引物2對位于基因分型片段之外的5′和3′之間的序列進行了擴增，引物2針對的范圍從起始密碼子到終止密碼子前23個堿基處，有編碼7個氨基酸的堿基序列不在其內，含有papA絕大多數堿基序列。PCR擴增結果發現，針對HJ2菌株基因組能夠擴增到522 bp片段，而未能從TK3菌株中擴增到產物，這說明同為基因11型的APEC的P型菌毛papA基因堿基序列在基因11型堿基序列之外的區域存在一定的差異。為進一步弄清不同菌株完整的papA基因堿基序列的差異，又運用引物3對TK3菌株的完整papA基因進行擴增，并測定了堿基序列，但未能從HJ2菌株中擴增到完整的papA基因堿基序列。基因堿基序列比對后發現，HJ2菌株和TK3菌株菌毛papA基因的5′端有相同的堿基序列，而3′則存在多處不同的堿基，僅在下游引物序列中就有2個堿基存在差異，這就是引物3能從用HJ2菌株中擴增出產物而不能從TK3菌株中擴增出產物的根本原因。將測得的TK3菌株和HJ2菌株菌毛PapA蛋白氨基酸序列進行了比對，發現分型引物間的區段基因編碼的氨基酸序列基本相同，但對TK3菌株來說，PapA蛋白氨基酸第20位氨基酸為蘇氨酸(T)，HJ2的第20位則為天冬酰胺(N)，TK3菌株和HJ2菌株的其他PapA部位也有2處氨基酸存在變異，分別位于第147和151位。這說明即使同屬于同一個基因分型，不同菌株的papA基因和編碼的氨基酸序列也不是完全相同的，且papA基因分型與菌體血清型關系不大。

為了更全面比較分析不同血清型菌株papA之間的差異，通過DNA-Star軟件分析，將TK3菌株的PapA蛋白氨基酸序列與相似度較高的F165 PapA和來自人尿道感染的大腸桿菌P型菌毛PapA蛋白氨基酸序列進行了比對，結果發現分型引物間的區段序列基本相同。在分型區外的區域，5′端同源性較高，3′端變異非常明顯。值得注意的是，TK3菌株雖然屬于papA基因11型，卻是以基因14型的papA上下游序列為模板設計的引物3擴增出來的。該引物擴增papA區域外的papB和papH之間的序列，其5′端位于papA上游papB基因的3′端，3′端則位于papA下游papH基因的5′端，該對引物能夠擴增出完整的papA基因。由此可見，雖然本研究擴增papA具有偶然性，但恰好說明了papA基因分型不同的菌株其papB和papH基因卻可能存在較大的相似性。相反，運用引物3卻未能從HJ2菌株中擴增到完整的papA片段，這反映了即使papA基因分型相同，其上下游papB和papH基因卻可能存在變異，從另一個方面證明了通過現有基因分型劃分APEC P型菌毛不一定具有代表性，提示用papA基因擴增分型對APEC P型菌毛進行檢測分類有一定的意義，但是其他分子生物學特征則需要綜合分析。

papA是編碼P型菌毛PapA蛋白的基因，約1 000個PapA蛋白亞基組裝形成彈簧狀菌毛桿，從而形成菌毛的主體結構[8,10]。PapA蛋白雖然不直接參與細菌的宿主作用，但仍然與細菌的致病性存在密切的關系。主要表現在菌毛桿連接著黏附性蛋白PapG，沒有PapA蛋白，PapG蛋白將失去支撐。而彈簧狀菌毛桿也可以通過伸縮來調節菌毛的長度，便于接近宿主細胞。目前，人源大腸桿菌papA基因分布較廣，且因變異出現14個基因型，但這些變異不影響菌毛的表達和黏附作用。禽大腸桿菌papA基因型均屬基因11型，其變異與致病性的關系尚不知曉。大多數APEC缺乏完整的操縱子基因簇，因而較少能夠克隆到表達菌毛的基因簇重組載體[9]。究其原因，可能存在新的變異位點而沒有檢測出來。有的菌株papA基因還插入了抗生素抗性基因，與細菌耐藥性保護機制有關[9]，這也會影響到PCR擴增檢測結果。本研究測定的papA基因未發現有抗生素抗性基因插入的現象，有關機制尚需進一步研究。

綜上，本研究通過設計合成的多對引物，獲得了papA基因的克隆，經比對分析發現屬于基因11型，從而獲得papA基因克隆重組菌，為致病性大腸桿菌菌毛毒力因子的檢測、菌毛亞單位疫苗的研制提供了一定的依據。研究結果還證實，APEC不同菌株P型菌毛papA基因雖然同屬基因11型，但仍然處于變異過程之中，隨著檢測樣品數量的不斷積累，新的變異類型可能還會被發現。