常見益生菌耐藥性研究進展

吉 星， 李 俊， 王 冉， 何 濤

(江蘇省農業科學院農產品質量安全與營養研究所/省部共建國家重點實驗室培育基地——江蘇省食品質量安全重點實驗室，江蘇南京210014)

益生菌是一種具有活性的微生物，當攝入適當的量時，可對人體產生有益的效果[1]。目前已有大量的益生菌資源被挖掘，如乳桿菌，芽孢桿菌，雙歧桿菌和腸球菌等。益生菌通常應用在奶、肉等食品發酵、日常飲食補充或配合抗生素給藥治療等[2]。還有一些研究結果證明益生菌對一些慢性疾病具有治療或預防作用，如肥胖、糖尿病、心血管疾病和慢性腸炎等[3]。除此之外，隨著世界各國對養殖及飼料產業“減抗、禁抗和替抗”的政策要求，益生菌作為熱門的抗生素替代產品，也越來越多地出現在飼料添加劑中。

盡管傳統上常用的益生菌被證實對人類無害，但從監管角度來看，并非所有的益生菌都可以被稱為“公認安全”狀態(Generally Recognized As Safe，GRAS)。近年來，由于抗生素的過度使用及超級耐藥病原菌的出現，越來越多的人擔心細菌耐藥性將對全球公共健康產生威脅。益生菌作為在自然環境和人體內大量存在的常駐菌群，可能成為潛在的耐藥基因儲存庫，并存在傳播和擴散耐藥基因的風險[4]。在全球關注公共衛生和食品安全的背景下，益生菌的耐藥性及其耐藥基因轉移性的研究具有重要的科學意義。本綜述旨在歸納和討論從發酵食品、益生菌產品中分離的常見益生菌對抗生素的耐藥情況和耐藥基因轉移風險，以期對益生菌的安全規范管理和使用提供理論依據。

1 中國允許使用的益生菌種屬

中國通常以菌種名單列表和行政許可公告的形式發布允許使用的益生菌菌種。目前，國家衛生健康委員會發布了《可用于食品的菌種名單》、《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》和《可用于保健食品的益生菌菌種名單》，規定了人類使用的益生菌主要為雙歧桿菌和乳桿菌。此外，農業農村部還針對養殖業使用的微生物菌種發布了《飼料添加劑品種目錄》，其中除常見的乳桿菌和雙歧桿菌外，還包括腸球菌和芽孢桿菌等。

乳桿菌最早在20世紀初由Elie Metchnikoff于保加利亞發酵乳中分離，并由此提出了最早的“益生菌”概念[5]。乳桿菌為厚壁菌門厭氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，不產生孢子，主要包括嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌等。雙歧桿菌最早于1900年健康嬰兒糞便中分離，為放線菌門嚴格厭氧的革蘭氏陽性桿菌，不產孢子，主要包括長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌等[6]。芽孢桿菌也是最常見的益生菌之一，已被廣泛使用了60多年。芽孢桿菌為厚壁菌門需氧革蘭氏陽性桿菌，可產芽孢，主要包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等[7]。腸球菌為厚壁菌門需氧或兼性厭氧革蘭氏陽性菌，不產芽孢，主要包括糞腸球菌和屎腸球菌等[8]。

2 益生菌的藥物敏感性評價標準和方法

根據各國益生菌使用基本準則和微生物耐藥性防控的要求，益生菌在使用前需要進行抗菌藥物敏感性試驗，但藥敏試驗結果會受測試菌屬、培養基組成、培養條件及培養時間的影響。目前關于益生菌的抗生素敏感性評價尚未有統一的標準。

根據益生菌菌種不同，常參考美國臨床實驗室標準協會(CLSI)、歐洲食品安全局(EFSA)和國際標準化組織/國際乳制品聯合會 (ISO/IDF) 推薦的微量肉湯稀釋法或瓊脂稀釋法進行抗菌藥物敏感性測試。例如，對于乳桿菌屬益生菌的抗菌藥物最小抑菌濃度(MIC)測試可結合CLSI M45、ISO/IDF-10932標準和EFSA發布的《細菌對人類和獸醫重要抗菌藥物的敏感性評估指南》進行；雙歧桿菌屬益生菌可參考CLSI M11和ISO/IDF-10932等標準。除了以上這些參考標準和方法，也可使用紙片擴散法和抗生素濃度梯度法(E-test法)對益生菌進行藥物敏感性測試。有報道稱紙片擴散法和E-test法得到的嗜酸乳桿菌MIC結果與標準的微量肉湯稀釋法結果具有一致性[9]。盡管這些方法都可以得到有效的益生菌藥敏數據，但實驗室內不同批次相同種屬的細菌應使用同一種方法，才能保證數據的可重復性和可比較性。

3 常見益生菌的耐藥性

與很多致病菌一樣，益生菌也會表現出對多種抗菌藥物的耐藥性(表1)，包括固有耐藥性和獲得性耐藥性兩種類型。固有耐藥性主要是益生菌染色體基因編碼的，例如DNA位點的自發突變、藥物外排泵的存在、抗生素降解酶的分泌和細胞外膜結構藥物靶點的缺乏等[10]。而獲得性耐藥性是指細菌通過接合、轉化和轉導等方式獲得外源的基因片段而獲得耐藥性，這些耐藥基因通常位于可移動元件上，如質粒、整合子、轉座子和噬菌體等[11]。一般來講，益生菌的固有耐藥性不具有水平轉移擴散風險，而獲得性耐藥性具有轉移到其他致病菌的風險，應引起高度重視。

3.1 益生菌的固有耐藥性

3.1.1 乳桿菌 大多數乳桿菌對頭孢菌素、氨基糖苷類藥物、磺胺類藥物和硝基咪唑類藥物具有天然耐藥性，這可能和細胞壁的低滲透性和某些基因的自發突變有關，其具體機制有待進一步闡明[11-12]。有結果表明乳桿菌中染色體基因的突變會產生抗生素抗性，如鼠李糖乳桿菌菌株23S rRNA 基因中的單一位點突變降低了紅霉素對核糖體的親和力，賦予了其對大環內酯類藥物的抗性[13]。值得注意的是，幾乎所有的乳桿菌對萬古霉素具有天然耐藥性，這可能是由于乳桿菌的肽聚糖D-丙氨酸殘基被D-乳酸或D-絲氨酸取代，從而阻止了萬古霉素和乳桿菌的結合，維持了細胞壁的正常合成[14]。

3.1.2 腸球菌 部分腸球菌對β-內酰胺類藥物具有一定程度的天然耐藥性，是由于這些腸球菌表達的青霉素結合蛋白PBP(如屎腸球菌編碼的PBP5和糞腸球菌編碼的PBP4)與β-內酰胺類抗生素結合能力較弱，從而使藥物不能作用于腸球菌細胞壁[15]。此外，糞腸球菌對氨基糖苷類藥物也具有一定的固有耐藥性，這可能是位于染色體的保守基因aac(6′)-Ii編碼的氨基糖苷6′-N-乙酰轉移酶和efmM基因編碼的甲基轉移酶導致核糖體靶位變化有關[16-17]。同時，腸球菌的固有耐藥性也和一些ATP 結合盒超家族外排泵有關，如lsa基因可介導糞腸球菌或屎腸球菌對大環內酯類-林可霉素-鏈陽性菌素類抗生素(MLS)的抗性[18]。此外，腸球菌還具有從環境中直接吸收葉酸的能力，這導致甲氧芐啶-磺胺甲噁唑不能競爭抑制細菌的四氫葉酸合成途徑而產生了固有抗性[19]。

3.1.3 雙歧桿菌 雙歧桿菌對莫匹羅星具有天然抗性，其機制是一種特殊的異亮氨酰-tRNA合成酶基因(ileS)的表達導致了莫匹羅星的競爭抑制作用喪失，從而恢復了細菌的蛋白質合成能力[20]。此外，大多數雙歧桿菌對氨基糖苷類藥物不敏感，其原因是由于其缺乏細胞色素介導的藥物轉運功能[21]。還有部分短雙歧桿菌中編碼核糖體亞單位蛋白S12的rpsL基因突變可導致其對鏈霉素的高水平抗性[22]。

3.1.4 芽孢桿菌 芽孢桿菌對大多數的抗生素是敏感的，其固有耐藥性研究較少。目前有相關報道稱bcrA編碼的ABC 轉運蛋白可介導地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等對桿菌肽的固有抗性[23]。此外，位于染色體的erm(D)和erm(K)基因可介導副地衣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌對大環內酯、林可酰胺和鏈陽菌素-B類抗生素的耐藥性[24-25]。

3.2 益生菌的獲得性耐藥性特征

3.2.1 乳桿菌 乳桿菌最常見的獲得性耐藥基因為四環素類耐藥基因。迄今為止，已在羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和發酵乳桿菌等多種乳桿菌中檢測到位于質粒或轉座子上的四環素類抗性基因，包括編碼核糖體保護蛋白的基因tet(W)、tet(M)、tet(S)、tet(O)和tet(Z)和外排泵編碼基因tet(K)和tet(L)[26-27]。此外，乳桿菌屬益生菌還可攜帶其他常用藥物的耐藥基因，如cat基因可介導嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌等對氯霉素的耐藥性[28]，erm(A)、erm(B)和erm(C)基因可介導多種乳桿菌對紅霉素等大環內酯類藥物的耐藥性[29]，lnu(A)基因可介導羅伊氏乳桿菌對林可酰胺類藥物抗性[30]，aac(6′)-aph(2″)、ant(6)和aph(3′)-IIIa可介導植物乳桿菌對氨基糖苷類抗生素的抗性[31]。值得注意的是，除了植物乳桿菌中常見的blaZ基因，少數乳桿菌還攜帶β-內酰胺抗性相關基因blaTEM和碳青霉烯類耐藥基因blaOXA-48[32-34]。

3.2.2 腸球菌 腸球菌也具備獲得多種外源性耐藥基因的能力，如從奶制品中分離的屎腸球菌或糞腸球菌被檢測出多種抗性基因，如四環素耐藥基因tet(K)、tet(L)、tet(M)和tet(S),氯霉素耐藥基因cat，氨基糖苷類耐藥基因aadE、aph(3′)-IIIa和ant(6′)-Ia，紅霉素抗性基因erm(B)[35-36]。以上耐藥基因通常是由質粒和轉座子介導轉移的，例如Inc18質粒、pAMβ1質粒、Tn917和Tn916等[37]。糞腸球菌還可獲得ABC 轉運蛋白基因lsa(E)從而對林可酰胺、截短側耳素和鏈陽菌素A類藥物產生聯合耐藥性[38]。除了常見的藥物外，少數屎腸球菌因對一線藥物產生耐藥性而備受關注，如Tn3家族轉座子攜帶的vanA，vanB，vanC和vanM可編碼D-乳酸取代細胞壁五肽前體中的末端D-丙氨酸而介導腸球菌的萬古霉素抗性[39]。質粒攜帶的optrA、poxtA和cfr基因可通過編碼ATP 結合盒超家族外排泵或改變細菌23S rRNA的方式介導腸球菌對利奈唑胺等惡唑烷酮類藥物的抗性[40]。

3.2.3 雙歧桿菌 有關雙歧桿菌所攜帶耐藥基因的報道相對較少，主要為四環素類和大環內酯類耐藥基因。在嗜熱雙歧桿菌和動物雙歧桿菌中位于轉座子Tn5432上的編碼核糖體保護蛋白的基因erm(X)可介導其對大環內酯類藥物的耐受性[41]。tet(W)、tet(M)和tet(O)等四環素耐藥基因也在長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、動物雙歧桿菌和噬熱雙歧桿菌等雙歧桿菌中檢測到，其中以tet(W)最為普遍[42-43]。也有報道稱，盡管雙歧桿菌中的tet(W)基因整合在染色體中，但該基因的側翼通常是轉座酶靶序列或轉座酶編碼序列，在適當的條件下可能發生轉移[43-44]。

表1 益生菌菌種中鑒定的耐藥基因及其相關特征

4 益生菌耐藥基因的可轉移性

益生菌大多數是革蘭氏陽性菌，外源性的耐藥基因主要通過接合性質粒、轉座子和整合性接合元件等獲得或傳播到其他共生細菌中。目前益生菌中耐藥基因轉移報道較多的為四環素和大環內酯類耐藥基因，例如發酵乳桿菌、唾液乳桿菌攜帶的erm(B)和植物乳桿菌、短乳桿菌攜帶的tet(M)可在體外條件下以0.29×10-5CFU至1.39×10-5CFU(供體菌)的頻率水平轉移至糞腸球菌中[50]。唾液乳桿菌和羅伊氏乳桿菌攜帶的erm(B)、tet(M)、tet(W)和tet(L)基因不僅可在體外轉移至糞腸球菌中，也可在體內環境下轉移至其他腸道共生菌中，轉移頻率為2×10-3CFU(供體菌)左右[51]。除此之外，植物乳桿菌攜帶的tet(M)和erm(B)陽性質粒也可在體外和動物體內環境轉移到乳酸乳球菌和糞腸球菌中[52-54]。

除乳桿菌外，芽孢桿菌和雙歧桿菌的四環素耐藥基因也具有可轉移性。如Tn916家族介導的tet(M)基因和質粒攜帶的tet(K)基因可通過接合轉移的方式在芽孢桿菌、大腸桿菌、腸球菌和金黃色葡萄球菌中轉移[55-56]。雙歧桿菌和糞腸球菌的tet(M)基因的遺傳規律高度一致，表明相互間曾發生了水平基因轉移[42]。在體外條件下，tet(W)基因及上游區域的轉座酶基因，可低頻率地在長雙歧桿菌和青春期雙歧桿菌之間轉移[57]。值得注意的是，除四環素和大環內酯類耐藥基因外，萬古霉素耐藥基因vanA可在腸球菌不同菌種間轉移，并可向嗜酸乳桿菌轉移[58-59]。以上研究結果表明腸球菌不僅可與本菌屬其他菌種也可與其他共生細菌進行耐藥基因的交換，因此在益生菌的耐藥基因轉移過程中扮演重要角色(圖1)。

圖1 耐藥基因在益生菌及致病菌間的水平轉移Fig.1 Horizontal transfer of drug resistance genes between probiotics and pathogenic bacteria

5 結論與建議

總體來說，益生菌產品作為人體內細菌的補充，可能成為耐藥基因的儲庫，同時具有傳播耐藥基因的風險。益生菌中的耐藥基因像一把“雙刃劍”，在提高益生菌抵抗不良環境能力的同時，還可能通過水平轉移的方式傳播到共生菌和其他病原菌中，從而引起嚴重的健康問題。

中國人用和畜禽養殖用益生菌行業正在快速擴張[60-62]，但目前仍缺乏完善的益生菌產品安全使用管理規范，特別是對于益生菌的耐藥性問題尚未形成完善有效的評價標準。在未來的益生菌生產和使用中，亟需制定完善益生菌產品中使用菌種的安全性評估體系，嚴格做好益生菌產品中菌種的質量控制，同時需要對益生菌的耐藥基因和可移動元件進行全面檢測，從分子水平上評估益生菌耐藥基因的轉移風險，并采取適當的措施防止益生菌耐藥基因在使用過程中通過日常飲食、臨床治療以及畜禽養殖等過程的轉移和擴散，嚴格管控攜帶可移動耐藥基因和具有傳播風險的益生菌菌株。