辣椒抗PMMoV基因L4連鎖標記的驗證分析

朱雪梅, 郭廣君, 潘寶貴, 刁衛平, 劉金兵, 高長洲, 王述彬

(1.南京農業大學園藝學院，江蘇南京210095;2.江蘇省農業科學院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,江蘇南京210014)

中國是世界上辣椒、甜椒(Capsicumspp.)種植面積最廣、消費量最多的國家，常年播種面積在2.2×106hm2，約占世界辣椒播種面積的40%[1]。隨著中國辣椒種植面積的擴大、種植模式多樣化及氣候影響，辣椒病害發生日益嚴重和多樣。病毒病是辣椒生產上的主要病害之一，部分病毒病會嚴重影響果實品質，導致30%～70%的減產甚至絕收[2]。近年來煙草花葉病毒屬的辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)在國內大部分辣椒主產區發生，逐步成為常發性病害，在江蘇地區，其檢出率高達62.28%[3]。

1964年PMMoV在美國被發現[4]，隨后擴散至歐洲、澳洲及亞洲等地，成為一種世界性病害。1994年中國新疆石河子地區首次報道發現PMMoV[5]，目前全國多個地區均有該病毒的報道[6]。PMMoV侵染后，辣椒葉片癥狀不明顯，嚴重時出現褪綠斑駁和花葉癥狀，在果實上癥狀明顯，表現為果小、果面有褪綠斑駁、凹凸斑點，甚至出現畸形與壞死現象[7]。該病毒主要為種子傳毒、花粉帶毒和汁液摩擦傳毒，其中種子傳毒和花粉帶毒是遠距離傳播的主要途徑[8]。

L基因座位于辣椒11號染色體的端粒附近，目前發現5個等位基因(L0、L1、L2、L3和L4)，其中L1～L4是辣(甜)椒抗煙草花葉病毒屬病毒的主要抗性基因。根據煙草花葉病毒(TMV)在攜帶不同L等位基因的宿主上產生的不同癥狀，該病毒屬病毒可劃分成P0、P1、P1,2、P1,2,3、P1,2,3,45個致病基因型[9-11]。其中P1,2是目前辣椒大田和溫室生產中最為常見的致病基因型，L3基因對其具有很強的抗性，通過雜交等方法將L3基因轉育至商業品種中可很好地控制該致病基因型[11]。而P1,2,3致病性強于P1,2，且可克服L3的抗性，目前在中國多個省份已有發現。據報道，在枸杞辣椒(Capsicumchacoensecv.)PI260429中發現的L4等位基因對P1,2,3具有抗性[12]，并對其他致病基因型具有廣譜抗性[9]。中國農業科學院蔬菜花卉研究所辣椒課題組通過回交結合分子標記輔助選擇獲得了攜帶L4抗性基因、早熟、大果型甜椒自交系 PT83-163[13]。

目前針對L4基因定位的研究已有較多報道并開發出多個與L4抗性基因緊密連鎖的分子標記。2003年Matsunaga等[14]利用抗病材料AP-PM04和感病材料Mie-midori構建F2群體，鑒定出1個隨機擴增多態性DNA(Random amplified polymorphism DNA, RAPD)標記WA31-1500。根據擴增片段長度多態性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)標記L4-c開發出的序列特異性擴增區域(Sequence characterized amplified regions，SCAR)標記L4SC340距離L4基因1.8 cM，該標記為1個顯性標記[15]。通過對細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome，BAC)文庫082F03測序開發出的共顯性酶切擴增多態性序列(Cleaved amplified polymorphism sequences，CAPS)標記087H03T7距離L4基因1.5 cM[16]。Yang 等[17]在2012年鑒定出1個L4的候選基因，根據該候選基因的富含亮氨酸的重復序列(LRR)區間開發出L4segF&R標記，但是該標記與L4基因無法實現完全的共分離，說明該候選基因并不是L4基因。Lee等[18]通過分析2個BAC克隆(GenBank登錄號：FJ597539、FJ597541)設計出8對引物。比較ECW(L0)、Tisana(L1)、CM334(L2)、PI159236(L3)和PI260429(L4)5個基因型用引物L-V0-4擴增出的核苷酸序列，發現L4基因型的擴增序列中存在1個34 bp的序列缺失，據此開發出1個L4-SCAR標記用于L4基因的篩選。

綜上所述，目前開發出的與L4連鎖的標記中，L4SC340、087H03T7及L4-SCAR3個標記具有操作方法簡單、價格低廉等優點，適用于抗病材料大批量篩選。因此，本研究對上述3對標記進行驗證以期篩選出準確性最高且可用于輔助篩選攜帶L4抗性基因種質材料的分子標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的辣椒種質材料共103份，包括從國家蔬菜種質資源庫引種的辣椒地方品種、江蘇省農業科學院蔬菜研究所辣椒創新團隊高代育種材料和引種自美國農業部(United States Department of Agriculture，USDA)的種質資源。鑒于一年生辣椒中基本沒有攜帶L3和L42個抗性基因的種質材料，因此選擇攜帶有L3基因的抗性材料C.chinensecv. PI159236和攜帶有L4基因的抗性材料C.chacoensecv. PI260429作為抗病對照，7份感病育種材料作為感病對照。

1.2 辣椒DNA的提取

采用簡化的十六烷基三甲基溴化銨法(Hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB)提取辣椒DNA，本研究參考Loraine等[19]的方法。用1%瓊脂糖凝膠和超微量分光光度計檢測DNA的質量和濃度，統一調整DNA質量濃度為 50 ng/μl，保存于-20 ℃備用。

1.3 引物序列及反應程序

PCR 擴增體系總體積為 20.0 μl：DNA 模板 2.0 μl，2×TSINGKE? Master Mix 10.0 μl，上下游引物(表1)各 0.4 μl，用ddH2O 補充至 20.0 μl。

表1 3對與L4基因緊密連鎖的分子標記的引物序列

引物L4SC340的PCR擴增程序為：98 ℃預變性 3 min；98 ℃變性 20 s，50～65 ℃ (選擇合適的退火溫度)退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，35個循環；72 ℃延伸 7 min；4 ℃保存。鑒于該標記為顯性標記，為避免由于退火溫度導致的假陽性，對其最適退火溫度進行篩選，分別設置50 ℃、53 ℃、56 ℃、59 ℃、62 ℃、65 ℃ 6個退火溫度。

引物087H3T7的PCR擴增程序為：98 ℃預變性 3 min；98 ℃變性20 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，35個循環；72 ℃延伸 7 min；4 ℃保存。

引物087H3T7的酶切擴增多態性序列(CAPS)反應體系為 10.0 μl，包括 5.0 μl PCR 產物，0.2 μlSspⅠ內 切 酶，1.0 μl Buffer，用ddH2O補足至 10.0 μl，37 ℃下孵化3 h。

用2%的瓊脂糖凝膠檢測L4SC340和087H3T7的PCR產物。

L4-SCAR的PCR 擴增程序為：98 ℃預變性 3 min；98 ℃變性 20 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，30 個循環；72 ℃延伸 7 min；4 ℃保存。PCR 產物檢測：10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(180 V, 150 min)分離 PCR 擴增產物。電泳結束后，銀染法染色，觀察并記錄擴增結果。

2 結果與分析

2.1 辣椒育種材料田間PMMoV發病情況

2021年秋季，江蘇省農業科學院六合動物科學基地的辣椒育種材料在自然條件下部分表現出被PMMoV侵染后的狀況。其中7份育種材料在轉色期果面表現出明顯的褪綠斑駁、凹凸斑點、畸形與壞死等癥狀，因此選擇上述7份材料作為PMMoV感病對照。

2.2 標記L4SC340引物序列最佳退火溫度的確定

L4SC340為1個顯性標記，為明確PCR過程中引物的最佳退火溫度，避免假陽性，以攜帶L4基因的抗性材料PI260429和7份種質材料為試驗材料，設置6個退火溫度。結果(圖1)顯示，在50 ℃、53 ℃和56 ℃的退火溫度下，8份材料全部能擴增出目的條帶；在59 ℃退火溫度下，8份材料中有7份可擴增出條帶；在65 ℃的退火溫度下，包括L4抗源PI260429在內的8份材料全部無法擴增出目的條帶；只有在62 ℃下，8份材料擴增差異最為明顯。據此說明，62 ℃為L4SC340的最優退火溫度。

2.3 L4SC340、087H3T7和L4-SCAR標記的準確性分析

以攜帶L3基因的PI159236和攜帶L4基因的PI260429 2份抗病材料和7份田間癥狀明顯的感病材料為試驗材料，驗證L4SC340、L4-SCAR和087H3T73個標記的準確性。結果(圖2)顯示，L4SC340在攜帶L3和L4基因的2份材料中均可擴增出340 bp的條帶，在7份感病材料中的6份中同樣擴增出340 bp的目的條帶(圖2A)。087H3T7在攜帶L3和L4的抗性材料中擴增出440 bp的條帶且無法被SspⅠ內切酶酶切。7份感病材料中，5份材料的PCR產物可被酶切為300 bp和140 bp，與L0基因型一致，2份材料的PCR產物則被酶切為440 bp、300 bp和140 bp(圖2B)，呈現雜合狀態。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測L4-SCAR標記的PCR產物，結果并不理想，無法清晰地分辨抗感材料間的差異(圖2C)。針對上述問題，我們采用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，結果顯示，L4-SCAR為一個顯性標記，L3和L4抗性材料可擴增出102 bp、136 bp和150 bp 3條目的條帶，而7份感病材料中只擴增出136 bp和150 bp 2條目的條帶(圖2D)。

M：DL2000 marker；1～8：退火溫度為50 ℃，其中1為抗病材料PI260429，2～8分別為感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；9～16：退火溫度為53 ℃，其中9為抗病材料PI260429，10～16分別為感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；17～24：退火溫度為56 ℃，其中17為抗病材料 PI260429，18～24分別為感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；25～32：退火溫度為59 ℃，其中25為抗病材料PI260429，26～32分別為感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；33～40：退火溫度為62 ℃，其中33為抗病材料PI260429，34～40分別為感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；41～48：退火溫度65 ℃，其中41為抗病材料PI260429，42～48分別為感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125。圖1 標記L4SC340引物序列退火溫度的優化Fig.1 Optimization of annealing temperature for primer sequence of L4SC340

M：DL2000 marker；1:PI 159236；2:PI 260429;3:CQ009；4：CQ011；5：PQ215；6：PQ224；7：PQ261；8：LB122；9：LB125。1、2對應抗病材料，3～9對應感病材料。圖2 標記L4SC340(A)、087H3T7(B)和L4-SCAR(C和D)在9份抗感材料中的PCR產物Fig.2 PCR products of markers L4SC340 (A), 087H3T7 (B) and L4-SCAR (C and D) in nine resistant materials

2.4 L4SC340、L4-SCAR和087H3T7標記篩選抗PMMoV材料

利用L4SC340對93份辣椒種質材料進行篩選時發現，攜帶L3和L4基因的抗性材料可擴增出清晰的目的條帶，但是2份感病材料同樣能擴增出較為微弱的目的條帶。而93份種質材料中只有7份材料未擴增出目的條帶，其他材料均擴增出了目的條帶(圖3、表2)。

087H3T7標記在L3和L42份抗性材料中擴增出的目的條帶為440 bp，在2份感病材料中擴增出的條帶為440 bp、300 bp和140 bp，表現為雜合狀態。93份種質材料中23份種質材料擴增后酶切條帶為440 bp，與抗性材料的擴增條帶大小一致；58份種質擴增后酶切條帶為3條，表現為雜合基因型；10份種質擴增后酶切條帶為2條，表現為純合感病基因型；此外，還有6份種質材料未擴增出目的條帶，懷疑為操作誤差(圖4、表2)。

L4-SCAR標記在攜帶L3和L4基因的抗性材料中可擴增出102 bp、136 bp和150 bp的目的條帶，而從2份感病材料中不能擴增出102 bp的目的條帶，說明利用該標記可明顯區別抗病材料和感病材料，但無法區分攜帶L3和L4抗性基因的種質資源。93份種質材料中14份可擴增出102 bp的目的條帶，而79份材料中未擴增出102 bp的目的條帶。14份抗性材料中1份為國內地方品種關口田辣椒；其余13份則全部為從美國農業部(USDA)引種的材料且均屬于C.baccatum種。攜帶L3抗性基因的PI159236屬于C.chinense種，但是93份種質材料中的4份C.chinense種的材料中均未擴增出102 bp的目的條帶(圖5、表2)。

M：DL2000 marker；1: PI 159236；2: PI 260429; 3: CQ009；4：CQ011；5～97：93份辣椒種質材料。圖3 標記L4SC340在97份辣椒種質材料中的擴增情況Fig.3 PCR results of marker L4SC340 in 97 pepper germplasm materials

M：DL2000 marker；1: PI 159236；2: PI 260429; 3: CQ009；4：CQ011；5～97：93份辣椒種質材料。圖4 標記087H3T7在97份辣椒種質材料中的擴增情況Fig.4 PCR results of marker 087H3T7 in 97 pepper germplasm materials

M：DL2000 marker；1: PI 159236；2: PI 260429; 3: CQ009；4：CQ011；5～97：93份辣椒種質材料。圖5 標記L4-SCAR在97份辣椒種質材料中的擴增情況Fig.5 PCR results of marker L4-SCAR in 97 pepper germplasm materials

表2 97份辣椒種質材料信息及基因型

3 討論

L4SC340標記開發人員給出的退火溫度為65 ℃[15]，但本研究中在65 ℃退火溫度下，包括攜帶L4基因的抗性材料PI260429的8份材料中均未擴增出目的條帶。退火溫度設定為62 ℃時，PI260429可擴增出340 bp的目的條帶，其他7份隨機材料中有1份材料可擴增出目的條帶。據此，后續研究中以62 ℃作為最佳退火溫度。但是后續研究中，攜帶L3和L4基因的2份抗病材料和7份感病材料中僅有1份材料未擴增出目的條帶，無法區分抗病材料和感病材料；而93份種質材料中86份材料均能擴增出目的條帶。以上結果說明標記L4SC340退火溫度的穩定性不足，很容易造成假陽性，無法用于篩選攜帶L4抗性基因的種質材料。標記開發人員也發現該標記除了不能在攜帶L1等位基因的材料中擴增出目的條帶外，在攜帶其他L等位基因(L0、L2、L3和L4)的種質材料中均可擴增出目的條帶。此局限性導致該標記無法用于篩選攜帶L4抗性基因的種質資源，但是在L4抗性基因回交轉育過程中此標記可用于抗性單株的篩選[15]。于海龍等[13]以引進材料200375(抗PMMoV,含L4基因)為抗源，以甜椒自交系 83-163為回交親本，進行多代回交并自交，利用L4SC340分子標記輔助選擇結合苗期抗病性鑒定、形態選擇，選育了攜帶L4抗性基因、早熟、大果型甜椒自交系 PT83-163。在本研究中標記L4SC340退火溫度的穩定性不足，假陽性率很高。

據報道，087H3T7為共顯性標記，在所有辣椒材料中均能夠擴增出大小約 440 bp 的目的片段，L4L4基因型的材料不能被SspⅠ內切酶切開，L0L0基因型的材料能夠被酶切為大小約300 bp和140 bp 的2個片段，L4L0基因型的材料酶切后有440 bp、300 bp和140 bp 3條目的條帶[16]。本研究中攜帶L3和L4基因的2份抗性材料酶切后目的片段大小均為440 bp，而7份感病材料中有5份材料的PCR產物酶切后大小為300 bp和140 bp，另外2份材料的PCR產物酶切后的大小則為440 bp、300 bp和140 bp。標記開發人員認為該標記的一大優勢是可以區分L3和L4基因型材料，但是本研究中攜帶L3基因的PI159236和攜帶L4基因的PI260429的目的條帶完全一致。李寧等[20]利用該標記篩選攜帶有L4抗性基因的種質材料時認為L4L4基因型的純合抗病材料11 份，L4L0基因型的雜合抗病材料 1 份。但是該研究所用的抗性對照為攜帶L3抗性基因的PI 159236，這一結果同樣證明該標記不能區分L3和L4基因型材料。本研究利用該標記篩選出與L3和L4抗病材料條帶一致的種質材料23份，雜合材料62份。以上結果說明，087H3T7標記可以篩選出攜帶L3和L4抗性基因的種質材料，但不能區分L3和L4基因型材料，同時篩選出的雜合基因型的種質材料過多且不一定具有抗性。綜上分析，用標記087H3T7篩選攜帶L4抗性基因的種質材料，其準確性存在很大的問題。

Kim 等[15]認為鑒于L等位基因附近的基因序列是已知的，那么通過比較攜帶L4基因的種質材料與攜帶L0基因的種質材料間的序列差異即可開發出與L4抗性基因連鎖的分子標記。Lee等[18]基于此種設想，開發出1個與L4基因連鎖的L4-SCAR標記。該標記為顯性標記，攜帶L4抗性基因的材料可特異擴增出102 bp的目的條帶，攜帶其他等位基因的種質材料無法擴增出此目的條帶。本研究根據Lee等[18]的研究結果，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測L4-SCAR標記的PCR產物，但無法清晰地分辨抗病材料和感病材料間的差異。改用10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果顯示攜帶L4和L3基因的抗性材料均可擴增出102 bp、136 bp和150 bp的目的條帶，而7份感病材料中只擴增出136 bp和150 bp 2條目的條帶。利用該標記篩選出與抗性材料具有相同目的條帶的種質材料14份，且14材料均包含在087HT7標記篩選出的23份抗性種質材料中。這一結果說明該標記可以篩選出攜帶L3和L4抗性基因的種質材料，但是無法明確區分L3和L4基因型，同時該標記為顯性標記，無法區分雜合基因型。除標記開發人員，該標記還未被其他科研人員應用及驗證。本研究認為，該標記對L3和L4抗性基因篩選的準確性要高于標記L4SC340和087H3T7。

整體來說本研究檢測的3個與L4連鎖的分子標記均不能準確地用于篩選攜帶L4抗性基因的種質材料。其中標記L4SC340退火溫度不穩定，很容易造成假陽性，所以其篩選結果的準確性無法保障。標記087H3T7和L4-SCAR可以篩選出攜帶L3和L4抗性基因的辣椒種質，但無法區分攜帶L3和L4基因的抗性材料，同時087H3T7存在雜合基因型過高的問題。二者比較來說，L4-SCAR篩選的準確度高于087H3T7，但是L4-SCAR為顯性標記無法區分雜合基因型。因此在明確抗性材料基因型的情況下，L4-SCAR標記結合087H3T7更有利于L3和L4抗性基因轉育后代抗性單株的輔助篩選。