馬鈴薯bZIP家族的鑒定與表達分析

李 想， 馮建英， 魯黎明， 李立芹

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都611130)

轉(zhuǎn)錄因子作為一類特殊的蛋白質(zhì)，可以直接或間接地與順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，從而響應(yīng)外界環(huán)境刺激，調(diào)控細胞的增殖、分化及生長，進而應(yīng)對病蟲害、激素、高溫等生物與非生物脅迫[1-3]。堿性亮氨酸拉鏈(Basic region/leucine zipper motif，bZIP)類轉(zhuǎn)錄因子是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛參與植物的生長發(fā)育及逆境響應(yīng)機制[2,4-5]。馬鈴薯是中國主要的糧食作物之一，在實際生產(chǎn)中，干旱、高溫、高鹽、水澇等非生物脅迫嚴重影響著馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)的形成，進而造成巨大的經(jīng)濟損失[6]。因此，鑒定bZIP家族并分析其各個亞族在非生物脅迫下的表達情況，對馬鈴薯應(yīng)答非生物逆境脅迫的分子機制研究及提高非生物逆境條件下馬鈴薯的產(chǎn)量、品質(zhì)具有較為重要的意義。

植物bZIP類轉(zhuǎn)錄因子一般有3個區(qū)域，即保守結(jié)構(gòu)域、堿性結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈區(qū)，其中亮氨酸拉鏈區(qū)是一種α螺旋，通常由亮氨酸重復(fù)或其他疏水氨基酸組成，易通過環(huán)形成二聚體，并以此形式調(diào)節(jié)下游基因的表達[2,7]。保守的結(jié)構(gòu)域包括1個特定的氮-X7-R/K基序以及18個用于核定位和DNA結(jié)合的氨基酸。在植物中，bZIP蛋白能夠結(jié)合具有ACGT核心序列的順式調(diào)節(jié)元件，如在應(yīng)激反應(yīng)基因的啟動子中發(fā)現(xiàn)的G-盒基序(CACGTG)[2,8-10]。目前，很多植物的bZIP轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被鑒定出來[8,10-11]，其中擬南芥中有71個bZIP家族成員[8]，辣椒中有54個bZIP家族成員[12]，番茄中有76個bZIP家族成員[13]，棉花中有86個bZIP家族成員[14]，蘋果中有112個bZIP家族成員[15]，煙草中有105個bZIP家族成員[2]，黃花蒿中有78個bZIP家族成員[16]等。植物的bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族可以分為若干個亞家族，如Jakoby等[8]根據(jù)擬南芥bZIP家族成員的保守結(jié)構(gòu)域?qū)⑵浞譃锳～I和S等10個亞族，亞族之間的結(jié)構(gòu)與功能較為相似，如A亞族大多含有ABF/AREB，它們參與了脫落酸(ABA)的信號傳導(dǎo)以及部分非生物脅迫信號傳導(dǎo)；D亞族主要包含許多TGA，通常與抗病性相關(guān)[1]。在功能上，bZIP基因家族成員廣泛參與植物對非生物脅迫的響應(yīng)，如番茄的SiAREB參與了對干旱、鹽脅迫的反應(yīng)[17]；剛毛檉柳ThbZIP1基因的表達受到NaCl、聚乙二醇(PEG)、NaHCO3和CdCl2的脅迫誘導(dǎo)[18]；葡萄的VvbZIP23基因?qū)崦{迫有一定的應(yīng)答反應(yīng)[19-20]；擬南芥的AtbZIP17能直接或間接調(diào)控鹽脅迫應(yīng)答基因[21-22]；干旱和外源ABA處理會誘導(dǎo)水稻OsbZIP16的表達[23]；蘋果的MdbZIP26通過ABA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來提高植物對干旱、鹽脅迫的抗性[24]；玉米的bZIP轉(zhuǎn)錄因子ABP9可以提高棉花對干旱、鹽脅迫的抵抗能力[25]。

馬鈴薯原產(chǎn)于南美安第斯山區(qū)，其栽培歷史已經(jīng)超過7 000年[26]。目前，馬鈴薯已經(jīng)是全球的第四大主糧作物[12-16,27]。然而，目前關(guān)于馬鈴薯bZIP家族成員的功能研究尚不夠深入。本研究采用生物信息學(xué)方法，以擬南芥bZIP成員的蛋白質(zhì)氨基酸序列作為參考序列，在馬鈴薯全基因組蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行馬鈴薯bZIP家族成員的檢索與鑒定，分析其結(jié)構(gòu)、染色體定位及其編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，并構(gòu)建進化樹，并分析其在非生物脅迫下的表達模式，以期為馬鈴薯bZIP轉(zhuǎn)錄因子的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用材料為馬鈴薯組培苗，品種為川芋十號，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯研究中心提供。

1.2 材料的非生物脅迫處理

選取優(yōu)質(zhì)馬鈴薯組培苗進行脅迫處理。試驗設(shè)1個對照組、5個脅迫處理組，對照組無非生物脅迫，處理組分別用如下試劑進行處理：10 μmol/L KCl(低鉀)、1 μmol/L ABA、5% PEG-6000 (模擬干旱)、200 mmol/L NaCl(模擬高鹽)、10 mmol/L H2O2。每組處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)均包含5株馬鈴薯組培苗。

采用水培方式進行脅迫處理，在處理當(dāng)天與處理后3 h、6 h、12 h進行整株取樣，并將馬鈴薯組培苗在液氮中速凍，以備后續(xù)進行基因表達分析。

組培苗的培養(yǎng)、脅迫處理均在培養(yǎng)室中進行，培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光照度2 000 μmol/(m2·s)，光照時間14 h/d，暗處理時間10 h/d。

1.3 馬鈴薯bZIP基因堿基序列的獲得

以與bZIP結(jié)構(gòu)域相關(guān)的HMM文件作為檢索條件，利用Hmmer 3.0軟件在馬鈴薯全基因組相關(guān)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索同時包含bZIP1結(jié)構(gòu)域、bZIP2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)氨基酸序列，并去除包含HLH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)氨基酸序列[2]。然后，利用NCBI網(wǎng)站的CDD軟件去除不完整序列、錯報序列。

1.4 馬鈴薯bZIP蛋白理化性質(zhì)和亞細胞定位的預(yù)測

利用在線網(wǎng)站ExPASy對鑒定得到的馬鈴薯bZIP蛋白氨基酸序列進行理化性質(zhì)(等電點、相對分子質(zhì)量等)的預(yù)測。利用軟件ProtComp 9.0進行蛋白質(zhì)的亞細胞定位分析。

1.5 馬鈴薯bZIP家族系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

用MEGA 7.0軟件對71個擬南芥的bZIP、104個馬鈴薯的bZIP對應(yīng)的氨基酸序列及保守結(jié)構(gòu)域進行多序列比對，并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。采用Pairwise Deletion處理缺失數(shù)據(jù)以及用P-distance模型、Bootstrap檢驗1 000次的數(shù)據(jù)。

1.6 馬鈴薯bZIP基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測

用TBtools對馬鈴薯bZIP基因結(jié)構(gòu)進行可視化展示，用MEME對候選基因編碼的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測、分析，設(shè)置保守基序長度為6～50，數(shù)量為20個。

1.7 馬鈴薯bZIP基因的表達模式分析

從馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中下載馬鈴薯根、莖、葉3個組織及非生物脅迫下葉片中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[27]，其中非生物脅迫包括260 μmol/L甘露醇處理、50 μmol/L ABA處理、50 mmol/L NaCl處理，提取bZIP家族對應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的RPKM值，進行標準化后，用Tbtools進行繪圖。

1.8 馬鈴薯bZIP基因的表達驗證

根據(jù)所繪制的聚類熱圖，挑選PGSC0003DMT400020670等12個對非生物脅迫具有高度響應(yīng)的基因，根據(jù)其編碼序列(CDS)設(shè)計引物(表1)，預(yù)測的PCR產(chǎn)物包含基因外顯子，PCR產(chǎn)物長度為150～200 bp，用StACTIN作為內(nèi)參基因進行熒光定量PCR分析，用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

樣品總RNA的提取采用TRIzol法，cDNA的合成用Servicebio反轉(zhuǎn)錄試劑盒法。

qPCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸5 s，39個循環(huán)。qPCR反應(yīng)體系為20 μl，包括2.0 μl模板、10.0 μl SYBR GREEN Realtime PCR Master mix、各0.6 μl引物、6.8 μl ddH2O。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯bZIP基因家族成員的鑒定及其編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

利用Hmmer軟件鑒定bZIP基因家族成員，最終篩選出104個馬鈴薯bZIP基因。由表2可以看出，104個bZIP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域的長度為21～79 aa，相對分子質(zhì)量差異較大，為13 088.03～88 180.52，等電點為5.02～9.96，均屬于親水蛋白質(zhì)，大部分為非穩(wěn)定蛋白質(zhì)。104個bZIP成員中，54個定位于細胞核，50個定位于細胞間隙。

表1 馬鈴薯bZIP基因家族的熒光定量PCR引物

2.2 馬鈴薯bZIP基因家族系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

利用鄰接法構(gòu)建了馬鈴薯bZIP基因家族的系統(tǒng)進化樹。由圖1可以看出，104個馬鈴薯bZIP基因被劃分成10個亞族(A～I和S)；各亞族中馬鈴薯基因數(shù)為4～22個，差別較大，其中除了B、F、I這3個亞族外，大部分亞族(A、C～E、G、H、S)中的馬鈴薯bZIP編碼蛋白質(zhì)數(shù)量明顯多于擬南芥。此外，擬南芥bZIP分組結(jié)果與Jakoby等[8]的研究結(jié)果基本一致。

2.3 馬鈴薯bZIP轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

用MEME對bZIP蛋白的全長氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)分析，通過Tbtools軟件對結(jié)果進行可視化分析，并按照結(jié)構(gòu)相似性聚類，共得到20個Motif。由圖2可以看出，其Motif組成、位置和數(shù)量在不同亞族內(nèi)存在一定共性，但亞族之間存在較大差異，其中Motif1共存于98個成員中。

表2 馬鈴薯bZIP家族保守氨基酸序列位置及其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

圖1 馬鈴薯和擬南芥bZIP基因家族編碼蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of bZIP gene family encoded protein in potato and Arabidopsis

圖2 馬鈴薯bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子的模體(Motif)分布Fig.2 Motif distribution of bZIP family transcription factors in potato

2.4 馬鈴薯bZIP基因家族的染色體定位

根據(jù)馬鈴薯基因組的染色體位置信息，對104個bZIP基因進行染色體定位。結(jié)果表明，馬鈴薯中的104個bZIP基因不均等地分布在61條染色體上，其中2條染色體上均包含4個bZIP基因，其余染色體上則有1～3個bZIP基因。

2.5 馬鈴薯bZIP基因家族的表達模式分析

利用生物信息學(xué)手段分析馬鈴薯數(shù)據(jù)庫中bZIP基因在不同組織中的表達情況與響應(yīng)非生物脅迫的表達模式。由圖3A可以看出，在104個馬鈴薯bZIP基因中，PGSC0003DMT400025921、PGSC0003DMT400004821和PGSC0003DMT400030585基因在根、莖、葉中的相對表達量均最高；PGSC0003DMT400004821、PGSC0003DMT400019462基因只在莖中有高表達量；PGSC0003DMT400032381、PGSC0003DMT400032382基因只在葉中有高表達量，推測其在馬鈴薯莖、葉生長發(fā)育過程中起著重要作用；PGSC0003DMT400025921、PGSC0003DMT400030585基因在根系中的表達量非常高，提示其可能在根系的生長發(fā)育過程中起作用。

由圖3B可以看出，在響應(yīng)非生物脅迫方面，PGSC0003DMT400085559、PGSC0003DMT400030585和PGSC0003DMT400025921基因的相對表達量分別在ABA、NaCl和甘露醇(Mannitol)處理下最高。多數(shù)基因的相對表達量在ABA處理下較高，而PGSC0003DMT400085559基因的相對表達量只在ABA處理下較高，暗示其在響應(yīng)ABA中起著關(guān)鍵作用。在鹽脅迫及干旱處理下，PGSC0003DMT400020670、PGSC0003DMT400020671基因的相對表達量較高，可能與其對鹽、干旱逆境等脅迫的響應(yīng)有關(guān)。

A：組織表達模式；B：非生物脅迫下表達模式。圖3 馬鈴薯bZIP基因的表達模式分析Fig.3 Expression pattern analysis of bZIP gene in potato

2.6 馬鈴薯bZIP基因表達模式的驗證

為了驗證生物信息學(xué)分析結(jié)果，本研究采用熒光定量PCR方法分析所挑選的12個bZIP基因在不同組織中的表達模式。同時分別用5%PEG-6000、10 μmol/LKCl、200 μmol/LNaCl、1 μmol/L ABA、10 mmol/L H2O2對馬鈴薯組培苗進行脅迫處理，檢測所挑選的12個bZIP基因在脅迫處理前及脅迫處理3 h、6 h、12 h后的相對表達量，結(jié)果如圖4、圖5所示。

不同組織對應(yīng)的柱上標有不同小寫字母表示具有顯著差異(P<0.05)。圖4 馬鈴薯不同組織中部分bZIP基因的相對表達量Fig.4 Relative expression of some bZIP genes in different tissues of potato

同一類處理的不同處理時間對應(yīng)柱上標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5 馬鈴薯在不同逆境環(huán)境下基因的相對表達量Fig.5 Relative expression of genes in potato under different stress conditions

qPCR結(jié)果顯示，在本研究檢測的12個基因中，在馬鈴薯根中的相對表達量較高的有6個，分別為PGSC0003DMT400020670、PGSC0003DMT400020671、PGSC0003DMT400025921、PGSC0003DMT400013972、PGSC0003DMT400004821、PGSC0003DMT400012575。在莖中的相對表達量較高的基因也有6個，分別為PGSC0003DMT400020671、PGSC0003DMT400015830、PGSC0003DMT400030585、PGSC0003DMT400018306、PGSC0003DMT400018574、PGSC0003DMT400031184。在葉中，PGSC0003DMT400012575、PGSC0003DMT400006851基因的相對表達量均較高。總體來看，雖然qPCR的分析結(jié)果與利用生物信息學(xué)手段分析的表達模式結(jié)果有些差異，但基本一致。

在ABA脅迫處理下，與對照相比，12個基因中只有PGSC0003DMT400006851基因的相對表達量全部下降，PGSC0003DMT400020670基因的相對表達量變化不明顯，其他10個bZIP家族成員的相對表達量在脅迫3 h或6 h均有不同程度的上升(圖5)。在高鹽脅迫下，與0 h相比，除PGSC0003DMT400015830、PGSC0003DMT400006851基因的相對表達量下調(diào)外，其余10個基因均上調(diào)表達。在模擬干旱處理下，與0 h相比，PGSC0003DMT400006851、PGSC0003DMT400025921基因的相對表達量下調(diào)，其余10個基因整體表現(xiàn)為上調(diào)表達。

為了進一步探究馬鈴薯bZIP家族成員對非生物脅迫的響應(yīng)廣泛度，又進行了低鉀、H2O22個脅迫處理。圖5結(jié)果表明，在低鉀條件下，與0 h相比，有10個基因的相對表達量有一定程度的升高，其中PGSC0003DMT400004821、PGSC0003DMT400015830基因的相對表達量較高，PGSC0003DMT400013972、PGSC0003DMT400006851基因的相對表達量有所降低。在H2O2脅迫下，除PGSC0003DMT400006851基因外，其余11個基因的相對表達量均有所提高，其中PGSC0003DMT400004821、PGSC0003DMT400031184、PGSC0003DMT400012575等3個基因的相對表達量較高。

值得關(guān)注的是，與0 h相比，PGSC0003DMT400004821基因在5種脅迫條件下均高度表達，尤其是在低鉀條件下的相對表達量最高；而PGSC0003DMT400006851基因在所有脅迫條件下均下調(diào)表達。對馬鈴薯bZIP基因家族在非生物脅迫下表達模式的分析結(jié)果表明，該基因家族在馬鈴薯的逆境響應(yīng)中具有一定作用。

3 討論

本研究采用生物信息學(xué)方法[8,16]，共從馬鈴薯基因組中鑒定出104個bZIP轉(zhuǎn)錄因子。通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，將bZIP家族成員劃分成10個亞族。本研究的分組結(jié)果與擬南芥bZIP家族的分組結(jié)果大體一致[8]，初步證實了鑒定結(jié)果的準確性。在這10個亞族中，有7個亞族(A、C、D、E、G、H、S)包含的bZIP家族成員比擬南芥的多，1個亞族(B)的數(shù)量相等，2個亞族(F、I)的數(shù)量比擬南芥的少。通過對馬鈴薯bZIP蛋白進行結(jié)構(gòu)分析，得到20個Motif，其中Motif1的分布最廣泛，存在于98個成員中。由此可見，馬鈴薯bZIP家族在漫長的生物進化過程中發(fā)生了結(jié)構(gòu)及功能上的分化以適應(yīng)外界環(huán)境的變化。

基因的表達模式能夠在某種程度上反映其所發(fā)揮的功能。馬鈴薯的104個bZIP基因在馬鈴薯根、莖、葉中均有表達，并具有十分明顯的組織表達特異性。其中PGSC0003DMT400004821、PGSC0003DMT400019462基因只在莖中有高表達，PGSC0003DMT400032381、PGSC0003DMT400032382基因只在葉中有高表達，推測其分別在馬鈴薯莖、葉2個不同組織的生長發(fā)育過程中起重要作用；PGSC0003DMT400025921、PGSC0003DMT400030585基因的相對表達量在根系中非常高，提示其在根系的發(fā)育和對外界物質(zhì)的吸收等過程中扮演重要角色。

前人研究發(fā)現(xiàn)，bZIP基因廣泛參與植物對逆境脅迫的響應(yīng)[28-30]，如bZIP轉(zhuǎn)錄激活子Atf1參與Sty1-Atf1途徑響應(yīng)H2O2誘導(dǎo)的活性氧的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制[31]。bZIP家族A亞族成員對ABA有一定程度的響應(yīng)，但響應(yīng)模式不盡相同[16]。大豆中的bZIP基因Glyma04g04170可能通過負調(diào)控的方式參與耐澇應(yīng)答反應(yīng)[32]。在本研究中，馬鈴薯的多數(shù)bZIP基因在ABA處理下的相對表達量較高，其結(jié)果與擬南芥、煙草等的相關(guān)結(jié)果基本一致，且PGSC0003DMT400085559基因只在ABA處理下有較高的相對表達量，提示其在ABA響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。在鹽脅迫及干旱處理下，PGSC0003DMT400020670、PGSC0003DMT400020671基因的相對表達量較高，可以推測其在抗脅迫中的作用。PGSC0003DMT400085559、PGSC0003DMT400030585和PGSC0003DMT400025921等基因在ABA、NaCl、Mannitol脅迫下均具有高的相對表達量，說明它們在應(yīng)對這些非生物脅迫的過程中具有某種共同機制。

此外，還有一些基因，如PGSC0003DMT400004821、PGSC0003DMT400015830基因在低鉀脅迫下的相對表達量較高，在H2O2處理下，PGSC0003DMT400004821、PGSC0003DMT400031184、PGSC0003DMT400012575等3個基因的相對表達量顯著上調(diào)。上述結(jié)果均表明，bZIP基因家族在馬鈴薯抗逆響應(yīng)中發(fā)揮著廣泛作用。值得關(guān)注的是，PGSC0003DMT400006851基因在所有脅迫處理下均下調(diào)表達，表明該基因可能以某種負調(diào)控的方式參與了馬鈴薯的非生物脅迫響應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究采用生物信息學(xué)的手段從馬鈴薯基因組中鑒定出了bZIP家族的104個基因，可以分為10個亞族。在結(jié)構(gòu)上，這些基因編碼的bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子包含20個Motif，轉(zhuǎn)錄因子之間的Motif數(shù)量不同。馬鈴薯bZIP基因廣泛參與了干旱、高鹽、ABA等非生物脅迫的響應(yīng)過程，本研究結(jié)果能為馬鈴薯bZIP家族的功能研究奠定基礎(chǔ)。