抗氧化活性最佳佛手酵素正交法優(yōu)化制備

邱 遷，廖 蕓，孟 琦，周 鋒，閻怡平，張 華，2

（1.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404120；2.重慶市渝東北特色生物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，重慶 404120）

佛手屬于蕓香科柑橘屬植物[1]，是一種藥食同源植物，其花、葉、果均可入藥，具有疏肝理氣、和胃止痛的作用[2]。食品方面可加工成佛手蜜餞、佛手茶和佛手酒等。佛手主要功能成分包括揮發(fā)油、多糖、氨基酸、黃酮類化合物、香櫞脂類等化合物[3-5]。酵素是一種以水果、蔬菜為原材料，利用酵母菌、乳酸菌及其他益生菌發(fā)酵而形成的一種液體或固體食物，所含營(yíng)養(yǎng)成分非常較多，包括脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶等，具有抗炎、抗菌、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、降脂、解酒、保肝、美白及改善腸道微環(huán)境的功能[6-8]。由于其天然特性和無(wú)副作用而受到人們的廣泛追捧。目前，佛手主要通過(guò)售賣佛手果和盆景來(lái)獲得一定的經(jīng)濟(jì)效益。與國(guó)外相比，我國(guó)佛手果深加工產(chǎn)品較少[9]。因此，試驗(yàn)以佛手為原材料，通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)條件，以羥基自由基清除率為考查指標(biāo)，研究具有羥基自由基活性最佳佛手酵素制備工藝，為佛手的進(jìn)一步深加工和開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 樣本與主要試劑

野生新鮮成熟佛手果，外表金黃、皺而有光澤、購(gòu)自自重慶市萬(wàn)州區(qū)龍沙鎮(zhèn)。

無(wú)水乙醇、七水硫酸亞鐵、30%過(guò)氧化氫溶液，中國(guó)重慶川東化工集團(tuán)有限公司提供；水楊酸，成都市科龍化工試劑廠提供；無(wú)水葡萄糖，購(gòu)自當(dāng)?shù)厮幍辏还z酶，山東圣斯德食品添加劑有限公司提供；安琪活性干酵母，安琪酵母（伊犁）有限公司提供；紅棉純正紅糖，廣州市華僑糖廠提供；水為超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 主要儀器

722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司產(chǎn)品；FA1004型號(hào)電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HH.S型精密恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；FW80型高速試樣粉碎機(jī)，河北省黃市新興電器廠產(chǎn)品；ZXFD-5250型十段編程鼓風(fēng)干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；AIphal1-2 LDplus型真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品預(yù)處理

將新鮮佛手果切成薄片，置于60℃恒溫干燥箱中干燥4 d，粉碎后過(guò)40目篩，密封干燥保存。

2.2 酵母菌的活化

準(zhǔn)確稱安琪活性干酵母粉5 g加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的葡萄糖溶液50 mL，于30℃條件下進(jìn)行活化3~5 h。

2.3 酵素制備

2.3.1 工藝流程

佛手液的制備（佛手干粉1 g∶蒸餾水20 mL）→添加果膠酶反應(yīng)→煮沸糖化→滅菌→接種酵母菌→離心取上清液→真空冷凍干燥。

2.3.2 操作要點(diǎn)

準(zhǔn)確稱取5 g過(guò)40目篩的佛手果干粉，加入蒸餾水,料液比為1∶20（g∶mL），之后加入果膠酶0.21 g，作用15 min后，煮沸糖化1.5 h，加入不同量的紅糖，搖勻，然后放入滅菌鍋，在115℃條件下滅菌30 min。滅菌冷卻后在無(wú)菌環(huán)境下按不同接種量接種已活化的安琪高活性干酵母，放入恒溫箱中進(jìn)行發(fā)酵[10]。發(fā)酵后獲得酵素液，并通過(guò)測(cè)定羥基自由基的活性作為評(píng)價(jià)酵素功能的檢測(cè)指標(biāo)。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 酵母菌接種量的確定

設(shè)定糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，發(fā)酵時(shí)間36 h，發(fā)酵溫度30℃，分別考查不同酵母接種量（體積分?jǐn)?shù)）2%，4%，6%，8%，10%所得酵素的羥基自由基清除率。

2.4.2 糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

設(shè)定發(fā)酵時(shí)間36 h，發(fā)酵溫度30℃，酵母接種量2%，分別考查不同糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）10%，15%，20%，25%，30%所得酵素的羥基自由基的清除率。

2.4.3 發(fā)酵時(shí)間的確定

設(shè)定糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，發(fā)酵溫度30℃，酵母接種量2%，分別考查不同發(fā)酵時(shí)間36，60，84，108，132 h所得酵素的羥基自由基清除率。

2.4.4 發(fā)酵溫度的確定

設(shè)定糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，發(fā)酵時(shí)間36 h，酵母接種量2%，分別考查不同發(fā)酵溫度26，28，30，32，34℃所得酵素的羥基自由基清除率。

2.5 正交試驗(yàn)

在酵母菌接種量（A）、糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）4個(gè)單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，取3個(gè)考查水平，分別以發(fā)酵時(shí)間36，60，84 h和糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，15%，20%，酵母菌接種量4%，6%，8%和發(fā)酵溫度28，30，32℃對(duì)比試驗(yàn)。以所得酵素的羥基自由基的清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定酵母菌發(fā)酵的最佳工藝條件，每一次試驗(yàn)稱取佛手干粉為5 g。

正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)

2.6 測(cè)定羥基自由基的清除率

2.6.1 試劑配制

（1）9 mmol/L乙醇-水楊酸。精確稱取水楊酸1.243 g，然后用乙醇溶解，將溶解液移入100 mL容量瓶中用乙醇定容，然后取出部分在另一容量瓶中稀釋10倍。

（2）9 mmol/L硫酸亞鐵。精確稱取FeSO4·7H2O溶液2.502 g，加入蒸餾水溶解，將溶解液移入100 mL容量瓶中定容，然后取出部分在10 mL另一容量瓶中稀釋10倍。

（3）8.8 mmol/L H2O2。精確稱取30%的H2O2溶液9.926 g在小燒杯中，加入蒸餾水，然后移入100 mL容量瓶中定容，然后取1 mL置于另一100 mL容量瓶中稀釋100倍。

2.6.2 試驗(yàn)方法

取出一支10 mL試管，依次加入9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL和9 mmol/L水楊酸溶液1 mL，再加入稀釋后的佛手酵素液1 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL。充分搖晃均勻后，置于37℃熱水中水浴反應(yīng)30 min，取出冷卻，然后充分搖晃，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度為A1，此為試驗(yàn)組，不加樣品為空白組測(cè)得的數(shù)值為A，不加H2O2的為對(duì)照組，測(cè)得的數(shù)值為A0[11]。

式中：A——空白對(duì)照的吸光度；

A1——加樣品的吸光度；

A0——不加顯色劑H2O2。

2.7 真空冷凍干燥

將發(fā)酵液可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃縮到30%，通過(guò)真空冷凍干燥得到水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于5%的佛手果渣酵素粉。真空冷凍干燥條件為冷凍溫度-20℃，真空度10~20 Pa，冷阱溫度-45℃[12]。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著者進(jìn)行Ducan's多重比較。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著水平設(shè)置為p=0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 不同酵母菌接種量對(duì)佛手酵素液羥基自由基清除率的影響

酵母菌接種量與酵素羥基自由基清除率關(guān)系見(jiàn)圖1。

圖1 酵母菌接種量與酵素羥基自由基清除率關(guān)系

由圖1可知，酵母菌接種量為6%時(shí)，所獲得的羥基自由基清除率最大，最高可達(dá)到43.79%。達(dá)到最高清除自由基能力之后，隨著接種量的增加，羥基自由基清除能力逐漸降低。

3.1.2 不同糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)佛手酵素液羥基自由基清除率的影響

糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酵素羥基自由基清除率關(guān)系見(jiàn)圖2。

由圖2可知，當(dāng)糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)有一個(gè)峰值，在糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%時(shí)一個(gè)最低值，之后隨著糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，又有上升趨勢(shì)。總體清除自由基能力差別為27%~29%，差別較小。考慮成本等因素，認(rèn)為當(dāng)糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)為最佳。其他研究也表明，懷山藥酵素液SOD活性隨著糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先升高再降低，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時(shí)SOD活性最高[13]。

圖2 糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酵素羥基自由基清除率關(guān)系

3.1.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)佛手酵素液羥基自由基清除率的影響

發(fā)酵時(shí)間與酵素羥基自由基清除率關(guān)系見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵時(shí)間與酵素羥基自由基清除率關(guān)系

由圖3可知，最佳發(fā)酵時(shí)間為108 h，此時(shí)對(duì)羥基自由基的清除率最大，為28.34%。其次為60 h和132 h，羥基自由基清除率為23.27%和22.86%。分析原因可能是發(fā)酵菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了一些諸如SOD等抗氧化酶類清除活性氧。另一方面可能是酵菌本身就具有一定的抗氧化能力。例如，有研究發(fā)現(xiàn)酵母菌的細(xì)胞壁多糖能夠清除羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）等活性氧，起到抗氧化的功效[10]。但是隨著發(fā)酵時(shí)間增多，發(fā)酵原料物質(zhì)的消耗殆盡，便開(kāi)始呈現(xiàn)下降或是平穩(wěn)趨勢(shì)[14]。考慮到試驗(yàn)效率，選取60 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

3.1.4 不同發(fā)酵溫度對(duì)佛手酵素液羥基自由基清除率的影響

發(fā)酵溫度與酵素羥基自由基清除率關(guān)系見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵溫度與酵素羥基自由基清除率關(guān)系

由圖4可知，發(fā)酵溫度與酵素羥基自由基清除率關(guān)系研究結(jié)果表明，最佳發(fā)酵溫度為30℃，羥基自由基清除率最高達(dá)到34.4%，是最低值的1.36倍。可能是此時(shí)的溫度是適合生存酵母菌的最佳溫度，有利于酵素的形成，酵素的含量增高[13]。

3.2 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)見(jiàn)表2，L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

通過(guò)表2可以判斷出各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響的主次關(guān)系并確定最佳工藝提取條件。4個(gè)因素的極差順序?yàn)镽D＞RC＞RA＞RB，說(shuō)明發(fā)酵溫度對(duì)制備酵素對(duì)羥基自由基清除率的影響最大，酵母菌接種量次之，發(fā)酵時(shí)間再次之，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)其影響最小。根據(jù)總和的比較，發(fā)酵時(shí)間K2＞K3＞K1，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)K3＞K2＞K1，酵 母 菌 接 種 量K3＞K2＞K1，發(fā) 酵 溫 度K1＞K2＞K3得 到 的 制 備 佛 手 酵 素 的 最 優(yōu) 方 案 為A2B3C3D1，即發(fā)酵時(shí)間為60 h，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，酵母菌接種量為8%，發(fā)酵溫度為28℃時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率為26.33%±8.20%。

由表3可知，發(fā)酵溫度對(duì)佛手酵素羥基自由基清除率的影響差異極顯著，發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度影響差異顯著。

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在分析正交試驗(yàn)結(jié)果后，以得出的最佳提取工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在最佳提取工藝條件下，即發(fā)酵時(shí)間60 h，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，酵母菌接種量8%，發(fā)酵溫度28℃時(shí)平行試驗(yàn)3次，測(cè)定酵素液的羥基自由基活性，結(jié)果表明，26.25%±2.99%與正交最優(yōu)組合26.33%±8.20%基本一致。所以綜合以上因素，A2B3C3D1提取工藝條件較為理想，結(jié)果穩(wěn)定、合理。

3.4 佛手酵素制備

試驗(yàn)最后將最佳工藝所獲得成品濃縮至30%后，經(jīng)真空冷凍干燥后保存于-80℃冰箱中[12]。

4 結(jié)論

以佛手果為試驗(yàn)對(duì)象，依據(jù)羥基自由基抗氧化活性強(qiáng)弱制備酵素，分別考查了酵母菌接種量、發(fā)酵時(shí)間、糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度4個(gè)單因素，并進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化。試驗(yàn)表明佛手酵素具備羥基自由基清除能力，查閱文獻(xiàn)未見(jiàn)佛手酵素相關(guān)研究，但是與其他藥食同源食品酵素類似，具有ABTS和DPPH自由基清除能力[15]。試驗(yàn)選出的最佳發(fā)酵時(shí)間為60 h，與已有報(bào)道相符。在不同的原料、菌種，不同的的發(fā)酵工藝及目標(biāo)產(chǎn)物顯示酵素發(fā)酵的時(shí)間存在較大差異。例如，王俊偉等人[16]研究糙米發(fā)酵只需2 h，就可以產(chǎn)生γ-氨基丁酸含量較高的酵素。李豆[17]在新型水果酵素的研制過(guò)程中，發(fā)酵時(shí)間為1~3個(gè)月。郭偉峰等人[18]研制桑葚酵素飲料發(fā)酵所需時(shí)間24 h，SOD酶活力明顯提高。總體而言，最終選出抗氧化活性最佳的佛手酵素發(fā)酵工藝的最佳因素為發(fā)酵時(shí)間60 h，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，酵母菌接種量8%，發(fā)酵溫度28℃。同時(shí)，將得到的發(fā)酵液滅菌濃縮后通過(guò)真空冷凍干燥，制成佛手果渣酵素粉狀產(chǎn)品。