3 種方法在水中揮發酚能力驗證中比對研究

李蒙 朱小亮 孫步旭

（江蘇省宿遷環境監測中心，江蘇宿遷 223800）

1 引言

揮發酚是一種高毒物質，為原生質毒，水中酚達一定濃度時可影響水生動植物的生存，高濃度的酚能抑制水中微生物的生長繁殖，影響水體的自凈作用［1-2］。在現行的GB 3838—2002《地表水環境質量標準》和GB/T 14848—2017《地下水質量標準》中，都明確了其具體限值。揮發酚作為反映地表水水環境質量的重要環境因子，屬于河流、湖泊和飲用水水源地等的水環境監測的必測項目，是GB 3838—2002《地表水環境質量標準》基本24 項之一［3-4］。

目前，環境監測分析中，水中揮發酚檢測較多采用萃取分光光度法（以下簡稱“萃取法”）［5］，該方法操作繁瑣，耗時較長，萃取步驟操作要求較高，準確度難以保證，操作中需要用到易揮發有機溶劑三氯甲烷，長期接觸使用，對人體有潛在的危害。直接分光光度法（以下簡稱“直接法”）較多應用在工業廢水和生活污水的測定中，揮發酚連續流動注射法（以下簡稱“流動注射法”）目前尚未有統一的環境監測分析標準，因此這2 種方法在揮發酚考核中的應用較少［6-7］。

能力驗證是利用實驗室間比對評價實驗室能力的活動，通過參加能力驗證活動，能夠對數據有效性和可靠性進行客觀評價，同時也是實驗室內部質控的一種重要補充方式［8-9］。能力驗證活動除有特殊要求的項目外，一般對檢測方法沒有特別限定，因此十分有必要采用多種方法對考核樣進行測定，以保證結果的準確性。

本文以參加水中揮發酚檢測能力驗證計劃為契機，采用萃取法、直接法和流動注射法，對揮發酚標準樣品和考核樣品的測試結果進行比對并分析，為揮發酚盲樣考核提供一些思路，以便分析人員在揮發酚能力驗證時能有效選擇合適的檢測方法，使檢測結果更加準確可靠。

2 實驗部分

2.1 實驗基本原理

萃取法、直接法和流動注射法三者基本原理大致相同：待測樣品中的揮發酚在鐵氰化鉀作用下，于pH（10±0.2）介質中，與4-氨基安替比林反應，生成橙紅色的吲哚酚安替比林化合物，分別在波長460，510，505 nm 處測量其吸光度信號值。

2.2 主要儀器和試劑

儀器：可見分光光度計（型號：V1300），上海美析儀器有限公司，配20 mm 和30 mm 比色皿；連續流動注射分析儀（型號：Skalar SAN＋＋），荷蘭Skalar 公司；超純水機（型號：UPC-20UV），北京康銘時代公司；50 mL 比色管。

試劑：苯酚標準溶液（500 mg/L，批號102318，不確定度±2%）和揮發酚標準樣品［200363，（19.4±1.3）μg/L］，均購于生態環境部環境發展中心標準樣品研究所；4-氨基安替比林（優級純），默克公司；磷酸（85%）、氫氧化鈉、氯化銨、硼酸、鐵氰化鉀、氯化鉀和三氯甲烷等所用試劑除有特殊說明外，均為分析純。

2.3 溶液配制

2.3.1 苯酚標準中間液

用潔凈干燥移液管，準確移取10.0 mL 苯酚標準溶液至500 mL 容量瓶中，用無酚水稀釋至刻度線，得到10.0 mg/L 苯酚標準中間液，臨用現配。

2.3.2 萃取法標準溶液

分別準確移取0.00，0.25，0.50，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00 mL 苯酚標準中間液至250 mL 容量瓶中，加入無酚水稀釋定容至刻度線，標準溶液質量濃度分別為0.0，1.0，2.0，4.0，12.0，20.0，28.0，40.0 μg/L。

2.3.3 直接法標準溶液

分別準確移取0.00，0.50，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00，12.50 mL 苯酚標準中間液至50 mL 比色管中，加入無酚水稀釋定容至刻度線，標準溶液質量濃度分別為0.0，0.1，0.2，0.6，1.0，1.4，2.0，2.5 mg/L。

2.3.4 流動注射法標準溶液

分別準確移取1.00，3.00，5.00，8.00，10.00 mL苯酚標準中間液至100 mL 容量瓶中，加入無酚水稀釋定容至刻度線，標準溶液質量濃度分別為10.0，30.0，50.0，80.0，100.0 μg/L。

2.3.5 標準樣品和考核樣品溶液配制

按照揮發酚標準樣品和考核樣作業指導書要求，樣品需要稀釋后才能夠使用，具體方法為：用10 mL 潔凈干燥移液管，準確移取原液置于1 000 mL容量瓶中，用無酚水稀釋至刻度線，最終檢測結果按照稀釋后樣品測定結果的平均值計，測定結果單位為μg/L。

對于萃取法和流動注射法而言，本次實驗中，標準樣品測定按照作業指導書要求的方式進行測定；最終測試結果按照作業指導書上要求稀釋后結果進行計算上報。

目前使用的揮發酚標準品的濃度范圍普遍在0～100 μg/L 內，由此換算，使用到的揮發酚標準品原液的濃度普遍在0～10 mg/L 范圍內，而直接法測定的濃度范圍在0～2.5 mg/L 范圍，因此對于直接法而言，揮發酚標準樣品和考核樣采用移取5.0 mL 原液，按照直接法的操作步驟，加入無酚水定容至50 mL 比色管后，加入顯色劑，對樣品進行測定，測定結果按照稀釋10 倍結果計算上報。

2.4 結果計算

樣品中揮發酚的濃度按照下式計算：

式中，ρ 為樣品中揮發酚的濃度，μg/L；As為試樣吸光度值；Ab為空白吸光度值；a為校準曲線的截距；b 為校準曲線方程的斜率；V為試樣的體積；f 為稀釋倍數。

3 結果與評價

3.1 標準曲線

萃取法、直接法和流動注射法的線性回歸方程相關系數（r）分別為0.999 7，0.999 9，0.999 8，線性關系良好，具體情況見表1。

表1 3 種方法測定揮發酚校準曲線 μg/L

3.2 標準樣品測定

采用生態環境部環境發展中心標準樣品研究所的揮發酚標準樣品，其批號及對應的濃度分別為：批號200363，標準樣品標準值濃度為（19.4±1.3）μg/L。分別用3 種方法進行測定，每個樣品平行測定6 次，測定結果均在標準樣品標準值范圍內，具體情況見表2。

表2 標準樣品200363 的3 種方法測定結果

3.3 比對實驗結果評價

按照RB/T 208—2016《化學實驗室內部質量控制 比對試驗》要求［10］，對于任何形式的比對實驗，當每組檢測的平行測量次數n 較多（n≥6）時，可先將2 組比對數據按“F 檢驗”進行方差分析，判斷2 個均值的精密度差異是否為顯著性差異。若無顯著性差異，即為2 組測定結果等精密度，再進行“t 檢驗”對比，對實驗結果進行評價。

3.3.1 F 值檢驗及t 值檢驗

F 值檢驗公式如下：

式中，S1為2 組數據中標準偏差大的數值；S2為2 組數據中標準偏差小的數值。

t 值檢驗公式如下：

式中，x1為第一組測定結果的平均值；x2為第二組測定結果的平均值；s 為2 組等精密度測定結果的合并實驗標準偏差；n1為第一組測定的平行測定次數；n2為第二組測定的平行測定次數。

其中，2 組等精密度測定結果的合并實驗標準偏差（s）按照下式進行計算：

以揮發酚標準品表2 比對實驗結果為例，對結果進行統計學評價。萃取法和直接法測定揮發酚統計學評價結果：F＝1.009，查表F0.05（5，5）＝5.050，表明萃取法和直接法測定揮發酚的結果無顯著性差異；t＝2.028，查表t0.05（10）＝2.228，t＝2.028＜2.228，表明在95%的置信水平上，2 種方法在測定準確度上無顯著性差異。

萃取法和流動注射法測定揮發酚統計學評價結果：F＝1.995，查表F0.05（5，5）＝5.050，表明萃取法和流動注射法測定揮發酚的結果無顯著性差異；t＝1.868，查表t0.05（10）＝2.228，t＝1.868＜2.228，表明在95%的置信水平上，2 種方法在測定準確度上無顯著性差異。

直接法和流動注射法測定揮發酚統計學評價結果：F＝1.977，查表F0.05（5，5）＝5.050，表明直接法和流動注射法測定揮發酚的結果無顯著性差異；t＝0.468，查表t0.05（10）＝2.228，t＝0.468＜2.228，表明在95%的置信水平上，2 種方法在測定準確度上無顯著性差異。

3.3.2 方法比對結果

方法比對結果按照下式進行評價：

式中，y1，y2分別為第一種和第二種方法的測定值；U1，U2分別為y1，y2的測量不確定度，k＝2。

以表2 實驗結果為例，按照RB/T 208—2016《化學實驗室內部質量控制 比對試驗》要求，對萃取法、直接法和流動注射法測定揮發酚含量的不確定度進行評價，萃取法測定的結果為（19.8±0.45）μg/L，直接法測定的結果為（19.3±0.44）μg/L，流動注射法測定的結果為（19.4±0.32）μg/L，有證標準物質的標準品標準值為（19.4±1.3）μg/L，3 種分析方法結果均在證書認定值范圍內。

3.4 考核樣品的測定

分別用萃取法和流動注射法對能力驗證樣品進行6 次平行測定，用直接法對能力驗證考核樣品進行2 次平行測定，萃取法和流動注射法測定結果根據t 分布進行統計處理，當置信度為95%時，以平均值為中心，計算平均值的置信區間。

3.4.1 考核樣數據統計處理

萃取法測定平均值的置信區間為（50.0～51.2）μg/L，流動注射法測定平均值的置信區間為（50.5～51.0）μg/L，結合直接法測定的結果50.8 μg/L，最終確定本次考核樣結果為50.8 μg/L，具體情況見表3。

表3 考核樣測定結果

3.4.2 盲樣考核結果

能力驗證考核采用穩健統計Z 比分數法評價測定結果，｜z｜≤2，測定結果為滿意，2＜｜z｜＜3，測定結果為有問題，｜z｜≥3，測定結果為不滿意。根據水中揮發酚檢測能力驗證計劃結果報告［11］，考核結果詳見表4。本次考核測定評價結果為滿意，實驗室間z 比分數為-0.09。在本次考核中，考核實驗室測定樣品中位值為50.9 μg/L，最大值為62.1 μg/L，最小值為44.4 μg/L，考核滿意率為81.2 %。

表4 揮發酚考核樣品結果 μg/L

3.5 樣品測定建議

通過3 種方法的比較，結合標準品實驗數據結果分析，3 種方法測定結果均在真值范圍內，測定準確度無顯著性差異，都能夠滿足揮發酚標準品和盲樣考核的要求，相比較萃取法操作繁瑣、耗時較長、危害性較大等不利因素，直接法和流動注射法在實驗條件上具有操作簡單、分析時間短和有機試劑使用較少危害小的特點，因此在測定揮發酚盲樣時，建議優先考慮流動注射法和直接法相結合的方式，利用萃取法輔助進行驗證，能夠提高結果的準確性。

4 結語

通過本文研究，采用萃取法、直接法和流動注射法，分別測定揮發酚標準樣品，采用統計學檢驗和不確定度對比對實驗測定結果進行相關評價，得出了直接法、流動注射法在測定揮發酚標準樣品中與傳統手工萃取法無顯著性差異，3 種方法同時運用在揮發酚能力驗證考核測定中，最終考核結果為滿意。因此在揮發酚盲樣考核的過程中，建議優先采用流動注射法和直接法相結合的方式，利用萃取法進行驗證，能夠大大提高揮發酚考核結果的準確性。