固相萃取/超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定水中7 種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素

付曉燕

（遼寧省大連生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧大連 116023）

1 引言

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（Macrolides Antibiotics，MA）是一類分子結(jié)構(gòu)中具有12-16 碳內(nèi)酯環(huán)的抗菌藥物的總稱，屬于快速抑菌劑［1-2］，主要用于治療需氧革蘭陽性球菌和陰性球菌、某些厭氧菌以及軍團菌、支原體、衣原體等感染［3-4］。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素被廣泛用于醫(yī)院臨床治療和畜牧養(yǎng)殖業(yè)。當前，我國大量生產(chǎn)和使用抗生素，由于缺乏有效的抗生素監(jiān)管措施，排放的抗生素廢水會污染周邊水體，對生態(tài)環(huán)境造成嚴重影響。國家“十四五”環(huán)保規(guī)劃中要求開展新污染物監(jiān)測評估與治理，水質(zhì)抗生素的檢測和處理迫在眉睫。

目前抗生素的檢測方法主要有TTC 法、氣相色譜法、液相色譜法、微生物檢測法以及液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法等［5-8］，但針對環(huán)境水體中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測技術相對較少，相對于液質(zhì)聯(lián)用技術，其他檢測方法前處理非常復雜，檢測靈敏度低，準確度不夠，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。為了提高樣品抗生素檢測的準確性，本研究采用固相萃取（SPE）—液質(zhì)聯(lián)用技術，建立了水質(zhì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測方法，并成功地應用于大連市6 條主要河流地表水中抗生素的分析測定。本方法提高了大環(huán)內(nèi)酯類抗生素分析的準確性和靈敏度，節(jié)省了分析時間，為地表水中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素污染調(diào)查提供了科學依據(jù)和技術支撐。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀，Waters TQ Detector 新型離子源加熱型質(zhì)譜儀；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；Milli-Q超純水器；HLB 固相萃取柱：填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物，6 cc/200 mg；0.22 μm 有機相針筒式微孔濾膜過濾器，材質(zhì)為親水性聚丙烯，親水性聚四氟乙烯（PTFE）等。

甲醇與乙腈（色譜純，德國默克公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma 公司）；實驗用水為經(jīng)Milli-Q 凈化系統(tǒng)制備的超純水（經(jīng)0.22 μm 過濾膜）；氮氣、氬氣（純度≥99.999%）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）、抗壞血酸（分析純，天津科密歐化學試劑有限公司）。6 種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素標準品包括羅紅霉素（ROX）、替米考星（TIC）、紅霉素（ERY）、螺旋霉素（SPM）、阿奇霉素（AT）和泰樂菌素（TYL）；標準物質(zhì)純度均≥99%（百靈威公司）。

2.2 色譜條件

ACQUITYUPLCBEHC18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫條件見表1。流速0.2 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量10 μL。

表1 液相色譜流動相線性梯度洗脫程序

2.3 質(zhì)譜條件

電離方式為電噴霧電離ESI（＋），檢測方式為多反應監(jiān)測（Multiple Reaction Monitor，MRM）方式，利用保留時間和碎片信號比值判斷定性結(jié)果；電噴霧電壓3.5 kV；離子源溫度120 ℃；去溶劑溫度400 ℃。具體質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

表2 7 種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)

2.4 樣品制備

水樣靜置，取地表水100 mL 上清液，調(diào)節(jié)pH至2～3，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾除去懸浮顆粒物，準確加入250 mg EDTA Na2，采用HLB 固相萃取柱進行萃取。先后用10 mL 甲醇、10 mL 超純水活化HLB萃取柱。將水樣以2～5 mL/min 的流速通過固相萃取柱，上樣完畢后，用10 mL 超純水淋洗小柱，再用氮氣吹干小柱，最后用10 mL 甲醇洗脫富集后的固相萃取柱，并用接收管接收甲醇洗脫液，35 ℃氮吹濃縮至近干，加0.1%甲酸溶液定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，置于進樣瓶中等待進樣。

3 結(jié)果與討論

3.1 液相色譜條件的優(yōu)化

流動相的組成會影響目標化合物的色譜峰形、分離效果及離子化效率。比較了流動相中甲酸濃度對于離子豐度的影響，結(jié)果表明，流動相中加入甲酸能夠相對增強離子豐度，對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的離子化促進作用非常明顯。在該實驗中采用了甲醇/0.1%甲酸水溶液、乙腈/0.1%甲酸水溶液或含0.1%甲酸的乙腈/0.1%甲酸水溶液作為流動相，使用同一BEH C18色譜柱，在相同色譜條件下進行梯度洗脫分離，結(jié)果表明，0.1%甲酸的乙腈/0.1%甲酸水溶液作為流動相的峰形與峰高優(yōu)于其他流動相，且6 種抗生素分離度更好。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素分子結(jié)構(gòu)中的基團特征和化學電離性質(zhì)，實驗最終選擇MRM 模式，ESI（＋）模式進行掃描。為了獲得最佳的靈敏度和分離效果，首先采用連續(xù)直接進樣，掃描質(zhì)核比（m/z）范圍為10～1 000，分別對離子源溫度、電噴霧電壓、錐孔電壓、碰撞電壓、去溶劑溫度、錐孔氣流量等條件進行優(yōu)化，使調(diào)諧液中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的離子化效率達到最佳，最終得到6 種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在MRM模式下的質(zhì)譜參數(shù)

3.3 檢出限和標準曲線的線性范圍

配制羅紅霉素、替米考星、紅霉素、脫水紅霉素、螺旋霉素、阿奇霉素和泰樂菌素7 種抗生素的混合標準儲備液100.0 mg/L，并逐級稀釋成濃度分別為2，5，10，20，50，100 μg/L 系列的標準工作液，按樣品分析全過程，分析測定進樣量10 μL。以所得峰面積對抗生素標準溶液濃度進行回歸分析，線性關系良好。校準曲線、線性相關系數(shù)、檢出限（S/N＝3）、精密度和回收率見表3。

表3 7 種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的線性方程、檢出限、精密度和回收率

3.4 精密度和回收率

以經(jīng)測定不含有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的地表水為基質(zhì)，添加抗生素樣品中濃度為50 ，100 ng/L 2 個不同濃度的標準溶液，按篩選最優(yōu)的實驗條件，每個濃度樣品重復測量6 次，分別進行精密度和回收率的測定，測定結(jié)果見表3。

4 結(jié)論

本文建立了固相萃取/液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法對水中7 種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的快速分析方法，該方法通過HLB 固相萃取柱進行前處理分析，節(jié)省了水樣前處理過程中需要消耗的大量有機溶劑，并縮短了檢測時間，方法檢測限低至0.004～0.009 μg/L，分析速度快，操作簡便，定性準確，靈敏度高，穩(wěn)定性好。