外泌體作為診斷肺癌的標志物的研究現狀

陸秋琴 張琳琳 賈維

肺癌目前居全球范圍內癌癥死因的首位，占總癌癥死亡的25%；其5年生存率相當低，不到20%[1-2]。目前臨床中診斷肺癌的輔助檢查有多種方法：X線、低劑量螺旋CT、胸腔穿刺活檢、支氣管鏡檢查、痰脫落細胞學檢查及PET-CT等。盡管CT的敏感性高但其特異性仍比較低，會造成較高的假陽性[3]；而胸腔穿刺活檢并不是對每個患者都適用，其發生嚴重并發癥的風險高達15%[4]；由此可見，這些輔助檢查尚未能滿足臨床的需求。手術是目前治療肺癌預后最佳的手段，但大多數肺癌患者被確診時已是晚期，錯過了手術的最佳時機，可供選擇的治療方案相當有限，導致了晚期肺癌患者的5年生存率只有4%[1]。因此，亟須找出一種具有特異性的標志物來輔助肺癌的診斷。

外泌體是一種由腫瘤細胞(tumor cell, TC)、免疫細胞、干細胞和神經細胞等多種細胞分泌的納米級的細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)。它可以通過在鄰近細胞間或遠處受體細胞間傳遞蛋白分子、DNA、miRNAs這些物質來轉導信號，從而對細胞間的通訊起著重要的調控作用[2]。許多研究(見表1、2)證明了外泌體所含的蛋白及核酸有望成為診斷肺癌的可靠標志物，它的穩定性[5]和特異性[6]為其奠定了堅實的基礎。因此，本文旨在對近年來外泌體在診斷肺癌方面的研究現狀進行綜述。

表1 外泌體蛋白作為肺癌標志物

外泌體的概述

外泌體是1983年Johnstone 等在研究綿羊網織紅細胞成熟和分化的過程中發現的一種微小囊泡，隨后將其命名“exosome”，它是一種直徑為30-150nm的“茶托狀”扁平球體[7-9]。腫瘤細胞、免疫細胞、干細胞和神經細胞等多種細胞均能產生外泌體。它通過細胞的內吞作用和出芽形成[8]，存在于血液、尿液、胸腔積液以及唾液、腹水、腦脊液等各種體液中。目前提取外泌體的方法有：聚合物沉淀法、超速離心法、過濾離心法、尺寸排阻色譜法、免疫磁珠法等。外泌體由多種蛋白質，核酸，脂質等生物大分子構成，具有脂質雙層膜結構。它作為細胞間的通訊工具，主要通過以下三種方式介導細胞間的交流[2,10-11](見圖1)：第一，外泌體通過特異性表面分子與靶細胞進行識別并融合，即受體-配體的相互作用將其內所含的物質釋放至靶細胞，從而調節受體細胞的轉錄；第二，外泌體與靶細胞的細胞膜融合使內容物釋放到靶細胞的細胞質中，從而實現分子之間的轉運；第三，通過類似胞吞作用的機制傳遞信息到靶細胞。外泌體的特異性及靶細胞攝取外泌體的不同方式使其在細胞間通訊中的功能復雜化，目前尚不清楚不同的方式是否會造成外泌體的定位、降解或功能的差異[2]。

圖1 外泌體介導細胞間通訊的三種方式

外泌體在腫瘤中的作用

目前研究表明了癌細胞分泌的外泌體遠比正常細胞分泌的多，它能夠調制腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)以促進腫瘤的發生發展、侵襲轉移、血管生成、免疫逃逸等過程[12-13]；還可作為抗腫瘤藥物的有效載體，也可介導抗腫瘤藥物的耐受性[10](見圖2)。肺癌的發生與發展與腫瘤微環境之間復雜的相互作用息息相關。腫瘤微環境是腫瘤細胞賴以生存的內環境，由腫瘤相關成纖維細胞，干細胞，神經細胞，免疫細胞等及細胞外基質和物理因素如缺氧等組成。缺氧是TME的前提。Zhang等[14]的研究表明，缺氧的骨髓間充質干細胞分泌的外泌體通過STAT3誘導上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)極大地提高了腫瘤細胞的侵襲力，促進了腫瘤的轉移。此外，肺癌細胞分泌的外泌體中的miRNAs可在腫瘤細胞間傳遞遺傳信息，且其內含的蛋白質可以直接激活宿主細胞中的信號轉導，從而促進肺癌細胞的生長和增殖。研究[15]發現，外泌體 miR-1260b通過抑制分泌型卷曲相關蛋白(secreted frizzled related protein 1, sFRP1)和Smad4蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)來調節Wnt/β-catenin信號通路從而促進肺癌細胞A549的侵襲轉移。外泌體還可以通過刺激腫瘤血管生成來促使腫瘤的發展。相關研究表明，肺癌來源的外泌體的miR-210，可以通過激活JAK2/STAT3信號通路上調基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、FGF2和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等促血管生成因子的表達從而促進肺癌血管的生成[16]。在肺部TME中，腫瘤來源的外泌體攜帶免疫抑制分子，并將這些分子轉移到免疫細胞使之受到抑制。樹突狀細胞(dendritic cell, DC)可以捕獲這些外泌體分化為耐受DC，使原始的CD4+T細胞轉化為腫瘤抗原特異性調節性T細胞，從而抑制腫瘤特異性CD8+T細胞的功能，以促進腫瘤進展[12]。實驗還證明了外泌體是一種理想的藥物載體，Akhil等[17]的研究表明由外泌體介導的阿霉素傳遞，對TC表現出優先的細胞毒作用，減低了正常組織的毒性且療效更佳。腫瘤來源的外泌體可以介導抗腫瘤治療的抵抗，其機制尚未明了。EGFR突變的TC通過內吞作用將外泌體內化，進而激活PI3K/AKT和MAPK信號通路下游的外泌體野生型EGFR蛋白，從而引起對奧希替尼的耐藥性[18]。Li等[19]的實驗表明，exo-miR-613通過下調TC中的GJA1、TBP和eIF-4E的表達從而逆轉了NSCLC細胞對順鉑的耐藥性。外由此可見，外泌體的相關研究將為肺癌的診斷與治療帶來新希望。

表2 外泌體miRNA作為肺癌標志物

圖2 外泌體在腫瘤中的作用.即能促進腫瘤細胞的增殖、侵襲遷移、血管生成、免疫逃逸等；可作為抗腫瘤藥物的有效載體，也可介導抗腫瘤耐藥。

外泌體作為診斷肺癌的標志物

一、外泌體中蛋白質作為肺癌標志物

近年來許多研究表明外泌體中含有大量蛋白質，且外泌體蛋白參與肺癌的發生發展的各個環節，因此具有成為新的診斷肺癌工具的巨大潛力。Sandfeld-Paulsen等[3]采用細胞外囊泡陣列芯片對580例患者(431 例肺癌患者和150 例對照者)分離出的血漿外泌體蛋白的表達情況，發現CD151、CD171 和 TSPAN8 這三種外泌體蛋白在肺癌中的高表達，區分了肺癌患者與非肺癌患者且能區分肺癌的各組織亞型；其中CD151對肺癌的診斷價值最大，受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)下方的面積(Area Under Curve, AUC)為0.68；三者聯合檢測特異性更高，AUC值為0.938。Niu等[20]采用超速離心法將46例健康對照者和125例非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的血清分離出外泌體，再用質譜法對這兩組外泌體進行蛋白質組學分析，發現NSCLC患者的外泌體中α-2-HS-糖蛋白(alpha2-HS-glycoprotein, AHSG)和細胞外基質蛋白1(extracellular matrix 1, ECM1)的表達水平明顯高于健康對照組。AHSG對NSCLC的診斷價值最大，AUC為0.736(P<0.0001)；AHSG、ECM1與癌胚抗原結合診斷NSCLC，AUC值為0.938，對診斷NSCLC具有巨大的潛力。Sun等[21]的研究表明了唾液EVs含有信息豐富的蛋白質，利用質譜法對正常人和肺癌患者唾液EVs蛋白圖譜進行了系統比較。選其中6種相關外泌體蛋白徹底鑒定后，發現四種外泌體蛋白(BPIFA1、CRNN、MUC5B和IQGAP)具有腫瘤特異性，可用于檢測肺癌。探究體液中循環中外泌體的蛋白質組學差異，將為癌癥診斷的特異性和敏感性方面開辟新的領域。

二、外泌體miRNAs作為肺癌標志物

miRNA是一種短的單鏈非編碼RNA，通過促進靶mRNA的切割或抑制其翻譯在轉錄后水平調節基因表達[8]。相關研究已經證明了外泌體miRNAs在介導腫瘤的發生發展中扮演著重要的角色。且外泌體的結構是其成為標志物的重要因素，它的雙層脂質結構，包裹著miRNAs使其不被酶解，穩定攜帶細胞來源的各種生物活性物質在體液中循環。因此，它們能夠成為腫瘤的診斷標志物。Sun等[5]對72 例肺癌患者和72例健康者，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應，來檢測血清中外泌體miR-106b在NSCLC細胞系SPC-A-1、H 358、A 549和H 1229以及正常肺上皮細胞系Beas-2B中的表達，結果顯示肺癌患者和癌細胞系中血清外泌體miR-106b顯著升高。Han等[22]通過從56例LLC和40例HC的血漿外泌體中的 14 個miRNAs 的表達進行了比較，結果顯示，患者的循環外體miR-342-5p和miR-574-5p的表達顯著高于健康對照者，AUC值分別為0.733，0.780。因此循環外體miR-342-5p和miR-574-5p有可能作為早期肺腺癌的新的診斷生物標志物。研究[23]發現，NSCLC患者血漿中分離的外泌體中，miR-619-5p的表達高于正常，血漿外泌體miR-619-5p的表達，抑制了靶點RCAN1.4從而了促進NSCLC的生長和轉移。這些 miRNAs 具有診斷的肺癌的高敏感性及特異性，有望成為輔助診斷篩查肺癌的生物標志物。

三、外泌體DNA作為肺癌的生物標志物

目前從NSCLC細胞的外泌體雙鏈DNA(double-stranded DNA, dsDNA)中成功檢測EGFR突變，以及肺癌中的KRAS和p53突變，這使得外泌體中分離出的dsDNA作為診斷標記物將為肺癌的診斷開辟新的可能性。然而目前還未研發出能從人體中分離外泌體dsDNA的技術[24]。雖然腫瘤外泌體DNA檢測在肺癌的診斷中起著至關重要的作用，但測序儀器的可及性、數據分析和高昂的成本都是目前無法解決的限制因素。

結 語

隨著當代醫療技術的不斷發展，液體活檢正在成為診斷肺癌的微創方法，外泌體的發現和研究為肺癌的早期診斷開辟了新的途徑。外泌體作為無創或微創的肺癌標志物，可降低一些有創活檢引起的病情惡化風險，而且有望能有效延長患者生存期。然而要實現將外泌體領域的研究轉化為未來的臨床實踐，我們仍面臨著一些問題：首先是對外泌體在肺癌中的作用的進一步研究，以及靶細胞攝取外泌體的不同的方式，是否會導致外泌體不同的定位、降解或功能，以更好地闡明它們的作用及其作用機制；其次，解決外泌體的分離純化技術問題及尋找外泌體的靶基因；再次，目前外泌體作為標志物的研究仍缺乏大量臨床樣本驗證其有效性等問題。只有解決這些問題，外泌體才能夠廣泛應用于臨床。總而言之，外泌體的研究有著廣闊的前景，基于外泌體與肺癌的研究，有望能研發出可應用于臨床的肺癌診斷標志物，以達到提高肺癌患者5年生存率，延長肺癌患者生存時間的目的，造福更多的患者。