血清蛋白指紋圖譜預(yù)測放射性食管炎的初步研究

王 菁,楊瑞虹,李 杰

(1.山西省腫瘤醫(yī)院，山西 太原 030013；2.山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，山西 晉中 030619)

食管癌是目前世界上最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率占我國惡性腫瘤死亡率第4位[1]。放射治療雖然是失去手術(shù)機(jī)會(huì)食管癌患者極為重要的治療方式，但是約有20%～30%的患者因嚴(yán)重的急性放射性食管炎導(dǎo)致放射治療的中斷。因此降低食管癌患者近期和遠(yuǎn)期療效[2]。SELDI-TOF-MS技術(shù)是已經(jīng)發(fā)展的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，可用于檢測如血清、胸水及各種分泌物等標(biāo)本。本研究旨在對(duì)接受放射治療食管癌患者相關(guān)血清進(jìn)行檢測，篩選蛋白分子標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)差異蛋白，探究其對(duì)放射性食管炎的預(yù)測作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究收集2007年6月～2011年3月山西省腫瘤醫(yī)院收治的經(jīng)病理明確診斷為食管鱗癌患者38例，其中男23例、女15例；年齡42～81歲，中位年齡61.5歲；接受常規(guī)放射治療29例，適形調(diào)強(qiáng)放射治療9例；放射治療劑量60～70 Gy/ 30～35次/ 2Gy；食管病變完全緩解25例，部分緩解13例。

放射性食管炎按RTOG 急性放射損傷標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)： 0級(jí) 無癥狀；1級(jí) 輕度吞咽困難，無疼痛；2級(jí) 輕度疼痛，不能進(jìn)固體食物；3級(jí) 吞咽疼痛嚴(yán)重，勉強(qiáng)進(jìn)流食；4級(jí) 壞死/穿孔,瘺。

1.2 試劑和儀器

CHAPS、蛋白酶抑制劑、三氟乙酸、已氰、尿素和Tris-HCl等購自美國Sigma公司；U9緩沖液、WCX-2 buffer(結(jié)合緩沖液)、sinapinic acid(SPA)、超純水(HPLC) 蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)購于美國Ciphergen公司；weak cation Exchage(WCX-2)弱陽離子交換型蛋白質(zhì)芯片、Eppendorf離心機(jī)、-80℃冰箱。

1.3 方法

取晨起2 mL空腹血進(jìn)行血清分離，10 μL U9緩沖液對(duì)5 μL血清進(jìn)行稀釋；振蕩30 min。15 mL變性后樣品被加入180 μL WCX-2 buffer，總稀釋倍數(shù)約39倍。將WCX-2芯片置入處理器，每孔加入200 μL WCX-2 buffer，振蕩5 min，甩掉WCX-2 buffer。重復(fù)以上步驟一次。100 μL處理后樣品加入芯片處理器，4℃振蕩1 h。去掉樣品，每孔加入200 μL WCX-2 buffer，室溫振蕩5 min，去掉孔中液體，加入WCX-2 buffer，重復(fù)上述步驟。快速甩出每孔加入的200 μL HPLC。將芯片處理器取出，干燥后每孔再加入SPA 1 μL。最后上機(jī)測定。

1.4 數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析

利用Ciphergen Protein Chip 3.0版本分析數(shù)據(jù)；Biomarker Wizard軟件分析食管癌患者血清蛋白質(zhì)譜表達(dá)結(jié)果；采用Anova檢驗(yàn)比較差異蛋白。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

PBS-II C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)對(duì)差異蛋白峰進(jìn)行自動(dòng)收集。在相對(duì)分子量2×103～20×103范圍內(nèi)，經(jīng)Biomarker Wizard軟件分析。接受放射治療食管癌患者血清中，發(fā)現(xiàn)3個(gè)差異蛋白峰與放射性食管炎分級(jí)相關(guān)，且隨著放射性食管炎程度加重而呈高表達(dá)。在Ⅰ和Ⅱ級(jí)，Ⅰ和Ⅲ級(jí)放射性食管炎比較中，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)(表1、圖1)。

表1 3個(gè)差異蛋白峰在38例不同級(jí)別放射性食管炎中的表達(dá)比較(M ± SD)

圖1 6例發(fā)生不同級(jí)別放射性食管炎患者中3個(gè)差異蛋白峰的表達(dá)演變

3 討論

蛋白指紋圖譜技術(shù)利用激光脈沖輻射將芯池中分析物解析為荷電離子，根據(jù)不同質(zhì)荷比離子在儀器場中飛行時(shí)間的長短，制定一張質(zhì)譜圖案[3]。國內(nèi)外應(yīng)用這一技術(shù)已經(jīng)在肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和肺癌等方面顯示出較好的結(jié)果[4]。蛋白指紋圖譜技術(shù)在腫瘤早期檢測中的敏感性和特異性均在80%左右[3,4]。

為提高食管癌患者遠(yuǎn)期生存率，國際和國內(nèi)開展大量臨床研究，其中RTOG8501成為局部晚期食管癌由單一向綜合治療模式轉(zhuǎn)變的里程碑實(shí)驗(yàn)，成為局部晚期食管癌接受同步放化療的理論依據(jù)。同步放化療較單一放射治療明顯提高食管癌患者遠(yuǎn)期生存率，但是并發(fā)癥發(fā)生率和發(fā)生級(jí)別也相應(yīng)增加。放射性食管炎即為常見的急性期副反應(yīng)之一。它屬于一種非感染性炎癥。食管黏膜受到輻射，引起黏膜充血、水腫及糜爛，導(dǎo)致吞咽疼痛、進(jìn)食困難甚至吞咽梗阻的發(fā)生，尤以進(jìn)食硬性食物和刺激性食物時(shí)明顯。聯(lián)合化療，食管炎癥狀會(huì)顯著加重。可導(dǎo)致患者恐懼進(jìn)食，甚至飲水。隨著癥狀進(jìn)一步加重，可出現(xiàn)胸部劇痛、發(fā)熱和嗆咳等癥狀，最終有食管穿孔或食管氣管瘺發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)目前食管癌非手術(shù)治療現(xiàn)狀，怎樣做到對(duì)放射性食管炎的早發(fā)現(xiàn)和早防治，是臨床醫(yī)生急需解決的問題之一。探尋有效預(yù)測放射性食管炎的標(biāo)志物就顯得尤為重要。本研究利用蛋白芯片技術(shù)對(duì)接受放療的食管癌患者血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子量為2 639、2 816和5 744的3個(gè)差異蛋白峰在Ⅰ級(jí)放射性食管炎發(fā)展為Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí)時(shí)，峰值明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示上述3個(gè)差異蛋白峰如果呈逐漸高表達(dá)，預(yù)示放射性食管炎程度有加重趨勢。在臨床工作中，監(jiān)測Ⅰ級(jí)放射性食管炎患者血清中2 639、2 816和5 744 3個(gè)差異蛋白峰的變化，如果呈高表達(dá)，即需要格外警惕這類型患者是否屬于放射線敏感群體，是發(fā)展成高級(jí)別放射性食管炎的高危患者。針對(duì)這類型患者群體，臨床醫(yī)生在制定放療和化療方案，遵照相關(guān)臨床指南的同時(shí)，即需要遵循個(gè)體化原則，開展個(gè)體化治療，以保證食管癌患者抗腫瘤治療順利進(jìn)行，有效防止放射性食管炎向高級(jí)別發(fā)展，提高患者生存質(zhì)量，保證其近期和遠(yuǎn)期療效。在防治和干預(yù)過程中，可動(dòng)態(tài)觀測相關(guān)3個(gè)差異蛋白峰，其表達(dá)如果呈逐漸降低趨勢，則表明干預(yù)有效。反之，臨床醫(yī)師需要注意，這類型患者是否適合接受強(qiáng)度高于放療的同步放化療，是否適合接受高劑量放療劑量等。

本研究結(jié)果初步顯示血清蛋白指紋圖譜在放射性食管炎預(yù)測中的作用。由于研究樣本量偏少，需要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，對(duì)其進(jìn)一步深入研究，以期發(fā)現(xiàn)對(duì)放射性食管炎預(yù)測的有效標(biāo)志物，對(duì)其防治起到指導(dǎo)作用，保證食管癌患者抗腫瘤治療的順利進(jìn)行。