加味芍甘附子湯調控PI3K/Akt信號通路減緩類風濕關節炎相關間質性肺病進展的研究

康天倫 席雅婧 錢唐亮 朱躍蘭 侯秀娟

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的自身免性疫病，全球患病率為0.5～1%[1]。RA患者常容易伴發間質性肺病(interstitial lung disease，ILD)，類風濕關節炎相關間質性肺病(rheumatoid arthritis associated with interstitial lung disease，RA-ILD)在RA患者中的發病率從10～50%不等[2-5]，且以尋常型間質性肺病更為常見，嚴重影響RA患者的生命和生活質量。

研究表明，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase，PI3K/Akt)信號通路參與到了RA病理過程，與關節滑膜增生、滑膜炎、骨破壞有一定相關性[6]。在肺纖維化的過程中，研究發現活化PI3K/Akt信號通路，可激活下游中結締組織生長因子、血管內皮生長因子等細胞因子的表達參與肺纖維化，且可與核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等信號通路協同作用促進肺纖維化的形成[7]。前期研究表明加味芍甘附子湯治療以寒證為主的RA患者，在改善臨床癥狀等方面療效較好[8]，動物實驗研究也表明加味芍甘附子湯可改善佐劑關節炎大鼠關節滑膜的破壞[9]。在此基礎上，本研究擬觀察加味芍甘附子湯對膠原誘導的佐劑關節炎大鼠肺組織的組織病理形態及PI3K、Akt、NF-κB等相關蛋白表達的影響，探討加味芍甘附子湯治療RA-ILD的作用機制，為今后RA-ILD的中醫治療提供更多依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用清潔級Wistar大鼠48只，雌性，體質量(110±10)g，鼠齡6～8周，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。于北京中醫藥大學清潔動物房適應性喂養1周后，按照隨機數字表法分為空白組8只、造模組40只。

1.2 實驗藥物

加味芍甘附子湯藥物組成：白芍15 g、生甘草10 g、制附片15 g、青風藤15 g、雞血藤15 g。中藥飲片購買于北京中醫藥大學東方醫院中藥房，并由制劑室代煎。給藥劑量根據大鼠體表面積計算，將藥物濃縮成小、中、大劑量，分別為0.443 g/mL、0.885 g/mL和1.770 g/mL。藥液于4℃冰箱保存。

雷公藤多苷片，10 mg/片，生產批號：20200901，由湖南千金協力藥業提供。用蒸餾水將其配制成濃度為0.625 mg/mL的藥物混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原(Chondrex公司，貨號2002)，不完全弗氏佐劑(Sigma公司，貨號7002)，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染液(武漢皮諾飛公司，貨號PN0004)，一抗(VEGF)(servicebio公司，貨號GB11034)，一抗(CD34)(Abcam公司，貨號Ab81289)，一抗(KI67)(arigo公司，貨號ARG53222)，熒光二抗(cy3標記HRP山羊抗兔)(Jackson公司，貨號111-165-003)。

動物氣候箱(重慶永生公司，貨號SHH-500ZSD)，病理切片機(上海徠卡公司，貨號RM2016)，組織攤片機(浙江科迪公司，貨號KD-P)，烤箱(上?；厶┕?，貨號DHG-9140A)，脫色搖床(北京六一公司，貨號WD-9405A)，組化筆(Gene tech公司，貨號GT1001)。

1.4 造模、給藥及取材

1.4.1 模型制備 根據徐淑云《藥理學實驗方法》的制備方法，以及課題組既往造模經驗復制關節炎大鼠模型，將溶于乙酸的牛Ⅱ型膠原與等量不完全弗氏佐劑(IFA)混合，制備成濃度為2 mg/mL的混合物。將上述混合物置于15 mL離心管并垂直置于冰水中，離心管置于高速分散器下，以(1 000～3 000 r/min)攪拌2分鐘，暫停30秒冷卻，避免高速分散器轉頭攪拌過程中產熱導致蛋白變性，并反復數次使蛋白充分乳化，最終形成滴入水中而不散的“油包水”狀。隨后在大鼠左足和尾根部分別多點皮內注射0.1 mL，同時按壓注射部位使其充分吸收。7日后取0.1 mL于大鼠尾根部加強免疫一次。空白組僅在左足皮下注射0.1 mL的0.9%的生理鹽水。在接受上述免疫的第一天開始，參考劉建勛主編《病證結合動物模型擬臨床研究思路與方法》[10-11]，應用動物氣候箱制備寒證模型，條件設定為風速6 mL/s，溫度6℃，相對濕度95%。連續給予28天風寒濕刺激，造模時間持續4周。

1.4.2 動物分組及干預 將造模組隨機分為5組，每組8只，分別為模型組、中藥大、中、小劑量組及雷公藤組?？瞻捉M與模型組蒸餾水灌胃，其余4組分別給予相對應的藥物進行灌胃。按照成人每日服藥量的6.25倍來計算大鼠每日灌胃用量，計算后得出大鼠用量為：中藥大劑量組17.70 g/(kg·d)，中藥中劑量組8.85 g/(kg·d)，中藥小劑量組4.43 g/(kg·d)，雷公藤組6.25 mg/(kg·d)。按每只大鼠100 g/mL的灌胃量進行灌胃。同時將每日的給藥劑量分兩次給藥，兩次之間間隔6小時以上，連續灌胃4周。

1.5 檢測方法和指標

1.5.1 HE染色法觀察大鼠肺組織病理變化 灌胃4周后，將大鼠處死，沿大鼠腹部正中線剪開，充分暴露胸腔，鈍性分離出肺組織及支氣管，沖洗、濾干后將肺組織浸泡在4%的多聚甲醛中固定，進行包埋、切片、脫蠟、染色、脫水、封片、顯微鏡觀察肺組織形態結構變化。用Szapiel評分[12]標準進行肺泡炎評分。

1.5.2 免疫熒光法檢測肺組織PI3K、Akt、NF-κB的變化 將固定好的石蠟標本切片脫蠟，依次將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ/Ⅱ各15分鐘；無水乙醇Ⅰ/Ⅱ各15分鐘；85%和75%酒精各5分鐘；最終蒸餾水沖洗。將切片置于pH為6.0緩沖液中，并置于微波爐內修復。修復過程防止緩沖液過度蒸發以至干片。切片自然冷卻后置于pH為7.4的PBS中洗滌5分鐘×3次。滴加適合濃度的一抗，并將切片平放于4℃濕盒內孵育過夜。將切片先置于pH為7.4的PBS中洗滌5分鐘，共3次。甩干切片滴加熒光二抗，室溫避光孵育1小時。同上述步驟PBS洗滌、甩干后滴加DAPI，室溫避光孵育10分鐘。PBS洗滌、甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 加味芍甘附子湯對肺組織形態學的影響

HE染色結果顯示，空白組大鼠肺組織結構及肺泡壁完整，未見明顯炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺組織結構大面積破壞，肺泡結構塌陷，肺泡間隙充血水腫，肺泡壁增厚，出現大量纖維瘢痕；中藥小劑量組肺泡炎仍然較為明顯，肺泡結構紊亂，肺泡間隙仍較寬，較模型組有所改善；中藥中、大劑量組及雷公藤組肺泡結構較為清晰，伴有輕微炎癥反應及少量纖維增生，與模型組相比有較明顯的改善。見圖1。

肺泡炎評分結果顯示，模型組與空白組比較炎癥反應有明顯差異(P<0.01)；中藥中、大劑量組與模型組相比，肺泡炎癥和纖維化有顯著下降，差異有統計學意義(P<0.01)；雷公藤組與模型組相比也有明顯差異(P<0.01)。見表1。

注：A 空白組；B 模型組；C 中藥小劑量組；D 中藥中劑量組；E 中藥大劑量組；F 雷公藤組。

表1 各組關節炎大鼠肺泡炎程度評分比較分)

2.2 加味芍甘附子湯對肺組織中PI3K、Akt、NF-κB蛋白表達的影響

免疫熒光結果顯示，模型組中PI3K、Akt、NF-κB(Cy3標記呈現紅色熒光)的表達較空白組均明顯增多，且各治療組PI3K、Akt、NF-κB的表達與模型組相比均不同程度降低。見圖2。

熒光光密度值對比顯示，模型組吸光度值較空白組明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；各治療組較模型組吸光度值均有降低，與模型組相比，PI3K、NF-κB在中藥大劑量組與雷公藤組中降低更明顯(P<0.05)，與NF-κB在中藥中劑量組中降低更明顯(P<0.05)。見表2。

表2 各組關節炎大鼠肺組織PI3K、Akt、NF-κB平均熒光強度比較

3 討論

研究表明，PI3K/Akt信號通路是由酶聯受體介導的參與細胞增殖、遷移、存活和血管生成的經典信號通路[13]，與免疫介導的疾病相關[14]。其中，Akt是PI3K的下游底物?；罨腜I3K可以催化磷脂酰肌醇磷酸化產生第二信使，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(3-phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK)1和PDK2的幫助下完全激活Akt。Akt完全解離到細胞質和細胞核中，從而磷酸化靶蛋白，如NF-κB，完成對細胞外和細胞外信號刺激的反應，從而調節基因轉錄和翻譯、細胞增殖和凋亡等多種生物學效應和細胞活動[15]。在PI3K/Akt抑制劑渥曼青霉素和LY294002的作用下，RA患者外周血單核細胞產生的白介素-17被部分或完全阻斷，可減緩RA滑膜炎癥反應[16]。PI3K/Akt途徑介導的Blimp1表達上調可以促進RA破骨細胞形成[17]，充分說明PI3K/Akt信號通路在RA病理過程起到重要作用。PI3K/Akt信號通路在特發性肺纖維化中同樣發揮著重要作用，抑制PI3K通路可阻斷轉化生長因子-β誘導的α-平滑肌肌動蛋白表達和膠原生成的增加減緩肺纖維化的產生[18]。NF-κB在PI3K/Akt信號通路的下游表達。NF-κB信號通路在RA中起重要作用[19]，同時還可以促進成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，介導肺泡炎和肺纖維化[20]。

注：A 空白組；B 模型組；C 中藥小劑量組；D 中藥中劑量組；E 中藥大劑量組；F 雷公藤組。A1-F1 大鼠肺組織PI3K表達；A2-F2大鼠肺組織Akt表達；A3-F3大鼠肺組織NF-κB表達。

芍甘附子湯出自張仲景《傷寒論》，由芍藥、甘草、附子三味藥組成。白芍補肝陰，附子溫腎陽，一陰一陽相調和，甘草則安中。附子、甘草辛甘化陽以益衛，芍藥甘草酸甘益陰、養營補虛，三藥相合共奏扶陽益陰之效。在芍甘附子湯基礎上加上雞血藤、青風藤構成加味芍甘附子湯，雞血藤活血補血，青風藤祛風濕通經絡，使其更貼合于臨床RA以多關節疼痛為主要臨床表現這一特點。臨床研究表明，加味芍甘附子湯可縮短寒證RA患者晨僵時間，減少關節疼痛及腫脹個數，降低DAS28評分，改善患者生活質量[8]。動物實驗表明加味芍甘附子湯能有效調控JAK/STAT信號轉導通路STAT1 mRNA、SOCS1 mRNA、SOCS3 mRNA的表達，降低關節炎大鼠的炎癥反應[9]。

本研究發現，模型組大鼠肺組織結構較空白組被大面積破壞，肺泡結構改變，肺泡間隙充血水腫，肺泡壁相對增厚，出現大量纖維瘢痕，說明使用關節炎模型作為觀察RA相關間質性肺病的模型相對可靠，這與發表的相關實驗結果相一致[21]。各治療組肺組織形態學表現較模型組有不同程度的改善，表明加味芍甘附子湯對延緩關節炎大鼠肺損傷有一定作用。臨床中RA-ILD在影像學上大致可分為普通間質性肺炎、非特異性間質性肺炎、機化性肺炎三種類型[22]。雖然RA-ILD在影像學上常見以纖維化為特征的普通間質性肺炎，仍有一大部分患者表現出非特異性間質性肺炎的特點，以炎癥反應引起的雙肺磨玻璃影為主[23]。炎癥反應階段是可以被干預從而延緩纖維化進展的。研究發現[24]非特異性間質性肺炎患者經糖皮質激素治療后，45%患者完全恢復，42%患者改善或穩定。且非特異性間質性肺炎患者的5年生存期為76.2%，遠遠高于特發性肺纖維化(43.8%)[25]。本實驗大鼠肺病理改變治療組較模型組有一定改善，表明早期肺損傷有延緩其進展的治療機會。免疫熒光結果顯示PI3K、Akt、NF-κB在關節炎寒證大鼠肺組織中均有表達，與模型組相比各指標在治療組均有降低，且PI3K、NF-κB在中藥中、大劑量組與雷公藤組中降低更明顯，差異有統計學意義。研究已證明PI3K/Akt信號通路在RA及特發性肺纖維化中的重要作用[26-27]，本研究結果進一步豐富了PI3K/Akt信號通路在RA-ILD中的作用，將兩種疾病相關聯起到了“橋梁”的作用。

綜上所述，加味芍甘附子湯通過調節PI3K/Akt信號通路進而干預其下游NF-κB信號通路抑制炎癥反應，可能是減少肺泡炎及肺纖維化的重要機制。接下來的研究將進一步探究加味芍甘附子湯在治療RA-ILD過程中發揮作用的主要成分，以及更進一步的分子機制，為臨床中更精確有效的治療RA-ILD提供依據。