人參皂苷Rg3對食管癌放療患者體外免疫增強作用的探討

何昕

（江西省人民醫院腫瘤科 南昌 330006）

食管癌在全球發病率和死亡率普遍較高，而我國又是食管癌大國，放療作為食管癌的主要治療手段，治療的同時也會引起機體免疫功能下降，從而加快腫瘤的復發和轉移。單獨采用放療手段常無法得到滿意結果，因此，亟需尋找一種更佳的綜合治療方法，來提高患者放療后的免疫功能。人參對人體具有整體調節作用，一方面可以減輕放療引起的毒副反應，另一方面可以增強患者的免疫功能，降低癌癥復發轉移的風險。人參為補氣藥，主治氣、血、津液不足，被廣泛應用于惡性腫瘤輔助治療中。藥理研究證明，人參皂苷具有調節免疫作用[1~3]。有研究證實其能提高放療后鼻咽癌等其他腫瘤患者細胞免疫功能[4]，展現出良好的開發前景。為進一步證實人參皂苷Rg3可以改善食管癌放療患者的免疫功能，本研究擬在體外細胞學實驗中探討人參皂苷Rg3對食管癌放療患者免疫功能的改善及其相關機制。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年10月至2020年10月確診食管癌并在醫院接受調強放療的患者30例，其中男19例（63.3%），女11例（36.7%）；年齡46~71歲，平均年齡（52.9±6.3）歲；鱗癌29例，腺癌1例；Ⅰ期1例，Ⅱ期7例，Ⅲ期14例，Ⅳ期8例。

1.2 納入標準 經病理診斷確診的食管癌；KPS評分≥70分；心、肝、腎功能正常；于醫院接受調強放療。

1.3 排除標準 既往接受過放療者；有遠處轉移者；放療期間使用過人參制劑者；伴隨免疫性疾病者。

1.4 研究方法

1.4.1 分離、純化食管癌患者的淋巴細胞 分離：采集10 ml空腹靜脈血，抗凝處理后加入10 ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS）混勻，再將10 ml細胞分離液緩慢加入，然后離心18 min（800 rpm），用移液器移出管內的一層白色絮狀條帶液（即淋巴細胞）至EP管中。純化：先加RPMI1640培養液10 ml，混勻后離心15 min（800 rpm），去上清，重復3次，再用RPMI1640（含10%FBS）液重懸浮細胞，37℃恒溫箱培養24 h。

1.4.2 MTT比色法檢測淋巴細胞的增殖 將所得淋巴細胞洗滌3次，離心15 min（800 rpm），棄上清，用RPMI1640[含10%胎牛血清（FBS）]液將細胞濃度稀釋為2×106cells/ml后平鋪至96孔板，每孔200 μl，恒溫箱培養24 h。分為對照組及Rg3組，Rg3組分別加入不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L），對照組分別加入相同濃度的二甲基亞砜（DMSO）（1、10、100 mg/L），平行6份，其中3份加入刺激物絲裂原刀豆蛋白A（ConA）5 μg/ml，另外3份加入脂多糖（LPS）5 μg/ml。然后再用恒溫箱37℃培養72 h，培養結束后，在每個板孔內加入50 μl的MTT液，恒溫箱37℃培養24 h，離心15 min（800 rpm）后舍棄上清，每孔加入150 μl DMSO，然后計算OD 570 nm值。

1.4.3 流式細胞儀測淋巴細胞亞群PBS液洗滌淋巴細胞3次，離心10 min（800 rpm），棄上清，加RPMI1640（含10% FBS）液將細胞濃度調整為5×106cells/ml，平鋪至24孔板，每孔1 ml，恒溫箱37℃培養24 h。Rg3組分別加入不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L），對照組分別加入對應濃度的DMSO（1、10、100 mg/L），平行3份。培養箱37℃培養72 h，取100 μl細胞懸液，加入5 μl CD4+、CD8+檢測試劑混勻，室溫下避光孵育20 min，然后用流式細胞儀檢測CD4+、CD8+，計算CD4+/CD8+。

1.4.4 酶聯免疫吸附法 （ELISA）進行抗體的測定操作同上，將淋巴細胞的濃度調整為5×106個/ml，鋪板，恒溫箱37℃培養24 h。Rg3組加入不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L），對照組加入等體積的PBS溶液，平行3份。培養箱37℃培養72 h，采用ELISA法測定IgM和IgG抗體的水平。

1.5 統計學分析 采用SPSS20.0統計學軟件分析處理數據，計量資料以（）表示，采用t檢驗；計數資料以%表示，采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同絲裂原下Rg3對食管癌放療患者淋巴細胞增殖的影響 不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）處理接受放療的食管癌患者外周血淋巴細胞后，可促進由ConA誘導的淋巴細胞增殖，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），人參皂苷濃度越高，淋巴細胞的增殖程度越大；不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）可以促進由LPS誘導的淋巴細胞增殖，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），隨著人參皂苷濃度增高，淋巴細胞的增殖程度越大。見表1。

表1 不同絲裂原下Rg3對食管癌放療患者淋巴細胞增殖的影響（）

表1 不同絲裂原下Rg3對食管癌放療患者淋巴細胞增殖的影響（）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

LPS（5 μg/ml）1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L對照組Rg3組組別 n ConA（5 μg/ml）1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L 30 30 0.11±0.10 6.16±1.76*0.12±0.08 15.98±2.33*0.11±0.09 49.63±3.45*0.11±0.12 2.55±0.54*0.11±0.08 3.98±0.33*0.12±0.09 4.63±0.85*

2.2 Rg3對食管癌放療患者T細胞亞群的影響不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）處理接受放療的食管癌患者外周血淋巴細胞后，使得T細胞CD4+亞群的比例升高，差異有統計學意義（P＜0.05），并且隨著人參皂苷濃度的增加，其細胞亞群的比例越高；而經不同濃度人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）處理后，外周血中T細胞CD8+亞群的比例下降，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著人參皂苷濃度的增加，其細胞亞群的比例越低。見表2。不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）處理接受放療的食管癌患者外周血淋巴細胞后，使得T細胞CD4+亞群的比例升高，CD8+亞群的比例下降，從而導致CD4+/CD8+比值升高（P＜0.05），且隨著人參皂苷濃度的增加，其比值升高越明顯。見表3。

表2 人參皂苷Rg3對食管癌放療患者外周血CD4+及CD8+的影響（%，）

表2 人參皂苷Rg3對食管癌放療患者外周血CD4+及CD8+的影響（%，）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

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表3 人參皂苷Rg3對食管癌放療患者外周血CD4+/CD8+的影響（）

表3 人參皂苷Rg3對食管癌放療患者外周血CD4+/CD8+的影響（）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別 n 1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L對照組Rg3組30 30 0.74±0.10 0.94±0.06*0.72±0.08 1.32±0.13*0.73±0.09 1.97±0.45*

2.3 Rg3對食管癌放療患者外周血IgG和IgM抗體水平的影響 不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）處理接受放療的食管癌患者外周血淋巴細胞后，使得B細胞活化分泌免疫球蛋白IgG和IgM，人參皂苷組IgG和IgM水平明顯高于對照組（P＜0.05），且隨著人參皂苷濃度的增加，抗體的水平越高。見表4。

表4 Rg3對食管癌放療患者外周血淋巴細胞IgG及IgM抗體水平的影響（mg/ml，）

表4 Rg3對食管癌放療患者外周血淋巴細胞IgG及IgM抗體水平的影響（mg/ml，）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

0.56±0.13 5.73±0.61*IgM 1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L對照組Rg3組組別 n IgG 1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L 30 30 0.95±0.21 1.16±0.16*0.97±0.25 1.51±0.13*0.96±0.19 1.73±0.21*0.55±0.11 2.26±0.17*0.55±0.15 3.51±0.23*

3 討論

由于不良的飲食習慣及環境污染，我國食管癌的發病率呈逐年上升趨勢，危害人民的身體健康。大部分食管癌患者在療程中需要使用放療，放療是腫瘤治療的常用且重要的治療手段，在有效治療同時亦會導致機體的免疫抑制[5]。眾所周知，細胞免疫相關的淋巴細胞在抗癌活性中發揮著重要作用，且淋巴細胞屬于放射敏感性高的細胞系，放療會導致淋巴細胞數目減少，從而減弱抗腫瘤免疫應答。

人參是我國傳統的名貴藥材，屬于五加科植物，具有大補元氣、補脾益肺、生津止渴、安神益智的功效。而人參皂苷作為人參的主要活性成分，在藥理上具備一定的抗腫瘤活性，研究發現人參皂苷能促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，抗腫瘤細胞侵襲和轉移以及抑制腫瘤新生血管形成，并且其次級代謝產物人參單體的活性更強[6~7]。黃京子等[8]通過建立小鼠動物模型發現，人參皂苷Rg3除了可以起到放療增敏的作用外，還可以抑制腫瘤細胞的增長，誘導腫瘤細胞凋亡。既往研究發現，人參皂苷Rg3聯合放療還可以改善惡性腫瘤患者的免疫功能[9]。

淋巴細胞是機體重要的免疫成分，參與了免疫應答，放療產生的射線會殺傷外周血細胞，尤其是T淋巴細胞，導致淋巴細胞減少，不利于抗腫瘤免疫應答的誘生，引起機體免疫功能下降[10]。潘維華等[11]發現，小白鼠脾內淋巴細胞以及巨噬細胞，經過無水乙醇洗脫后，在人參皂苷的作用下，脾淋巴細胞及巨噬細胞的數量明顯提升，提示人參皂苷可以刺激小鼠免疫細胞的增殖起到免疫增強的作用。張仲苗等[12]對人參皂苷Rg3的研究中發現，Rg3能夠促進實驗鼠脾淋巴細胞的轉化和增強NK細胞的活性，預示無論是非特異性免疫還是特異性免疫均得以提高。在陳洪志等[13]的人參皂苷體外細胞實驗中，認為Rg3可提高接受放療的鼻咽癌患者外周血的細胞免疫功能。

絲裂原可以與淋巴細胞表面的相應受體結合，刺激淋巴細胞有絲分裂，是一種非特異性的淋巴細胞多克隆激活劑，而不同絲裂原作用的主要細胞不同，ConA誘導T淋巴細胞的分裂，LPS誘導B淋巴細胞的分裂。在本研究中，不同濃度（1、10、100 mg/L）的人參皂苷Rg3處理接受放療的食管癌患者外周血淋巴細胞后，結果顯示在不同濃度的人參皂苷Rg3中，淋巴細胞數在ConA、LPS誘導下分裂增殖的細胞數均得到提升，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性，人參皂苷Rg3濃度越高，細胞增殖越快。提示在不同濃度的人參皂苷Rg3作用下，接受放療的食管癌患者的T、B淋巴細胞增殖加快，且人參皂苷Rg3濃度越高，T細胞及B細胞增殖越快，從而促進了外周血免疫功能的活化。

T細胞參與機體細胞免疫，其中CD4+T細胞及CD8+T細胞是參與細胞免疫的主要細胞，兩者數量及其比例的改變影響著機體的免疫功能狀態，CD4+/CD8+比值升高提示機體免疫功能增強，反之提示免疫功能下降[4]。放療會影響機體的免疫功能，有研究通過流式細胞儀檢測食管癌患者的淋巴細胞亞群的比例，結果提示CD4+及CD8+均顯著下降，放療后甚至會出現CD4+/CD8+比例倒置[14]。在孫義長[15]的研究中，采用人參皂苷Rg3聯合新輔助放化療的方式治療胃癌患者，通過測量T細胞亞群的值及比例，發現在人參皂苷的作用下，CD4+及CD4+/CD8+比值均上升，因此認為人參皂苷聯合放化療能夠提高患者的免疫功能，改善生存。本研究采用不同濃度（1、10、100 mg/L）的人參皂苷Rg3處理接受放療的食管癌患者外周血后，通過流式細胞儀測量T細胞亞群中CD4+、CD8+值，結果發現經過人參皂苷Rg3處理后，各實驗組CD4+及CD4+/CD8+比值均有所升高、而CD8+在各組中表現為下降，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），且呈現出明顯的劑量依賴性，人參皂苷Rg3的濃度越高，CD4+及CD4+/CD8+比值越高、CD8+則越低。提示對于食管癌患者，放療通過殺傷外周血T細胞，使得各亞群數目下降、比例失調導致免疫抑制；不同濃度的人參皂苷Rg3則可通過調節改善T淋巴細胞亞群的比例，達到提高細胞免疫應答的作用，從而減輕放療所導致的免疫抑制作用，濃度越高，提高細胞免疫應答的作用越強。

B細胞則在體液免疫中擔任著要角色，通過分泌不同活性的免疫球蛋白，比如IgG、IgM等來誘導抗原-抗體反應，從而激活機體體液免疫達到提高機體免疫狀態的作用。宋振宇[16]將胃癌患者中的IgG與健康體檢者進行對比，發現的IgG的水平與胃癌患者的預后相關，IgG濃度降低，則患者的免疫功能下降，因此腫瘤患者的預后更差。譚江峽[17]在肺癌患者中同樣發現了此規律。本研究不同濃度（1、10、100 mg/L）的人參皂苷Rg3處理接受放療的食管癌患者后，測量外周血中IgM、IgG的濃度，結果發現各濃度組的IgM、IgG抗體濃度均升高，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著人參皂苷Rg3的濃度升高，外周血淋巴細胞分泌的IgM、IgG抗體濃度增高。本研究結果顯示，人參皂苷Rg3可以通過刺激活化食管癌患者外周血B淋巴細胞，使抗體分泌量增多，誘導抗原-抗體反應發生，從而提高機體的體液免疫活性，且其作用特征隨著濃度的增加而增大。

綜上所述，本研究通過對淋巴細胞增殖、淋巴細胞亞群比例、抗體分泌的檢測等一系列研究，證實人參皂苷Rg3對接受放療的食管癌患者的細胞及體液免疫功能具有促進作用，能夠改善放療后食管癌患者的免疫功能，并且隨著人參皂苷Rg3的濃度越大其免疫促進作用越強。