GeneXpert 和LPA 兩種方法檢測在診斷耐藥結核病中的價值

陳麗玲 鄧蓮 陳麗娟

（福建省龍巖市龍巖人民醫院檢驗科 龍巖 364000）

耐藥結核病是指機體對藥物的敏感性下降，導致藥物對肺結核治療療效降低，且隨著耐藥種類的增加，療效越差[1]。有研究顯示[2]，結核病主要經呼吸系統傳播，是全球十大死亡原因之一的疾病，由于疾病治療時間長，患者難以遵循用藥原則，因此極易產生耐藥性而加重病情，導致療效降低。及早診斷，并針對病情采取合適的治療方案是提高療效的關鍵。BACTEC MGIT 960 液體培養是現階段診斷該疾病的“金標準”，但液體培養時間較長，難以防控疾病，從而影響疾病得到及時有效的控制，探尋快速、有效的檢測方式對疾病的控制起著重要作用[3]。實時熒光定量核酸擴增檢測技術（GeneXpert）主要以實時熒光PCR 為原理，該檢測方式在準備樣品及核酸的提取環節完全實現自動化，檢測時間短，能快速得出檢測結果；線性探針檢測技術（LPA）在6~8 h 內可完成檢測，與GeneXpert 均具有快速檢測的特點[4]。由于兩種檢測方式均在臨床興起，且難以判斷兩者檢測效能，基于此，本研究探討GeneXpert 和LPA兩種方法在診斷耐藥結核病中的應用價值。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 將 2021 年3 月至 2022 年 3 月醫院收治的286 例疑似耐藥肺結核患者納入研究。所有患者進行GeneXpert 檢測、LPA 檢測，并進行BACTEC MGIT 960 液體培養，以液體培養結果作為金標準。其中男175 例，女111 例；年齡17~70 歲，平均年齡（44.25±12.30）歲；體質量指數（BMI）18~24 kg/m2，平均（20.36±1.55）kg/m2。納入標準：符合肺結核診斷標準[5]；心、肝、腎等功能正常；患者及家屬對本研究知情同意。排除標準：已經確診的耐藥性肺結核；伴有肺部惡性腫瘤。本研究經醫院醫學倫理委員會批準 [臨床項目審批件（2022）倫理第（56）號]

1.2 檢測方法 所有患者進行GeneXpert 檢測、LPA 檢測，并進行BACTEC MGIT 960 液體培養，以液體培養結果作為金標準。GeneXpert 檢測：嚴格根據檢驗規程操作，采集痰標本，確保在采集痰標本時選擇膿性及黏稠部分，將痰標本先后放置于2%N-乙酰 -L-半胱氨酸（NALC）-氫氧化鈉（NaOH）及無菌磷酸鹽緩沖液中進行離心處理，隨后將痰標本及處理液按照1:2 比例進行配置，采用漩渦振蕩10 s，并在室溫下靜置15 min，待痰液充分液化后取2 ml加入GeneXpert 核酸擴增儀內[賽沛（上海）商貿有限公司生產，型號Infinity-80]進行全自動檢測，約2 h 出結果報告。LPA 檢測：根據結核分枝桿菌及耐藥基因檢測試劑盒（國械注進20153402307）說明書操作。采用0.5 g NALC、50 ml NaOH 及50 ml 枸櫞酸鈉配制處理液，2 ml 標本在生物安全柜內轉移到50 ml 離心管中并進行標記。根據標本性狀，將1~2 倍體積前處理液在柜內向前處理管中加入，并將蓋子旋緊，渦旋震蕩30 s，待樣本充分液化，離心管在室溫下靜置15 min。在柜內打開旋蓋，加入45 ml 磷酸緩沖鹽溶液（PBS），隨后蓋緊螺旋蓋。配平離心管并放入離心桶中，離心20 min 后棄去上層清液，加入2 ml 緩沖液并混勻，將其放置于2 個1.5 ml 離心管中并進行標記。確定擴增體系數量，除DNA 樣本外，應制備所有擴增試劑混合物。將混合物進行混勻后瞬時離心，將45 μl 混合物貼壁加入PCR 管中，避免出現氣泡。隨后對處理液進行離心（12 000 r/min，5 min）處理，隨后根據PCR 儀設置好參數進行檢測。液體培養：采用藥敏板（美國賽默飛世爾科技公司）嚴格按照說明書以最低抑菌濃度法進行操作，利福平臨界濃度:1.0 μg／ml；耐藥標準：菌株MIc值＞臨界濃度為耐藥，MIc 值≤臨界濃度為敏感。

1.3 觀察指標 觀察GeneXpert 檢測、LPA 檢測的檢測結果和檢驗效能，檢驗效能包括準確度、靈敏度、誤診率、特異度、陰性預測值與陽性預測值。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0 軟件處理分析數據，計數資料以%表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 檢測結果對比 286 例肺結核患者經液體培養確定耐藥性肺結核（陽性）279 例，不耐藥性肺結核（陰性）7 例；經 GeneXpert 檢測發現陽性 275 例，陰性11 例；經LPA 檢測發現陽性273 例，陰性13 例。見表1。

表1 檢測結果對比（例）

2.2 檢驗效能對比 GeneXpert 檢測準確度（95.80%）、誤診率（4.20%）、特異度（42.86%）、靈敏度（97.13%）、陰性預測值（27.27%）、陽性預測值（98.55%）與LPA 檢測準確度（93.71%）、誤診率（6.29%）、特異度（14.29%）、靈敏度（95.70%）、陰性預測值（7.69%）、陽性預測值（97.80%）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 檢驗效能對比（%）

3 討論

耐藥性結核病可分為單耐藥結核病和多耐藥結核病，出現的耐藥種類越多療效越差。有研究指出[6]，耐藥結核病因對藥物的不敏感性而導致治療效果差，且全球對結核病控制所面臨的日益突出問題即是耐藥結核病的流行，對于該疾病的治療，需要明確其耐藥性以制定針對性治療措施，而及時做出診斷便是治療前的關鍵步驟[7]。近年來，臨床已經將液體培養作為臨床診斷金標準，主要是將獲取的標本接種于液體培養基中，使微生物均勻地在液體培養基中生長繁殖的一種培養方法，但此項技術培養時間較長，而結核病病情發展較快，即便后續得以診斷，也有可能會耽誤治療[8]。GeneXpert 結合了定量PCR分子遺傳檢測所需的三個步驟，即準備樣品、擴增及檢測，能快速報告樣本中是否存在結核分枝桿菌及其是否利福平耐藥的特點；LPA 旨在對基因突變予以檢測以判斷結核桿菌是否對利福平等抗結核藥產生耐藥性，且檢測時間較液體培養時間短，具有快速診斷的特征[9]，但GeneXpert 與LPA 的診斷效果并未明確，因此本研究探討對比上述兩種檢測技術效果，以選擇更有效的檢測方式為臨床提供更可靠的依據。

本研究結果顯示，經GeneXpert 檢測發現陽性275 例，陰性11 例，準確度為95.80%、誤診率為4.20%、特異度為42.86%、靈敏度為97.13%、陰性預測值為27.27%、陽性預測值為98.55%；經LPA 檢測發現陽性273 例，陰性13 例，準確度為93.71%、誤診率為6.29%、特異度為14.29%、靈敏度為95.70%、陰性預測值為7.69%、陽性預測值為97.80%。兩種檢測方法的準確度、誤診率、特異度、靈敏度、陰性預測值及陽性預測值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。說明GeneXpert 和LPA 兩種方法檢測在診斷耐藥結核病中效果相當，后續檢測可根據實際情況選擇，但由于兩者均存在誤診風險，因此還需引入其他檢測方式，為實驗室提供更精準的依據。這可能是因為檢測方法的不同，其使用前對標本的處理方式也不同，且在檢測過程中并不能保證痰樣本性狀黏稠度相統一，不能平均分配（特別針對一些低陽性級別痰液樣本）；同時，還可能是因為檢測方法的不同，其檢出限度也不相同，這也會對檢測效能產生影響。與液體培養技術相比較，GeneXpert 主要在封閉反應盒內自動進行標本檢測，該技術簡單、快速、易操作，同時具有不易污染等特點，且該技術是基于巢式PCR 技術的基因擴增技術，在針對基因利福平核心區間以設計引物及探針，可在短時間內檢測是否發生突變。劉春平等[10]學者研究指出，由于液體培養檢測技術陽性培養時間需要11~22 d，而Genexpert 從開始檢測到得出報告時間只需要2.5 h，相較于液體培養檢測技術能有效縮短檢測時間。GeneXpert 主要采用半定量熒光定量PCR 技術原理，在理論上可獲取高效的檢測敏感度。方木通等[7]學者表示，該技術主要利用巢式PCR 為檢測基礎，是一種集成、全自動的擴增平臺，且檢測過程在封閉環境中進行，將樣本制備、核酸擴增及檢測集成一體，短時間（2 h）內完成核酸的擴增及耐藥性的確認，便于及時對患者病情進行處理。現有研究表明[11]，rpo B 基因及異常突變是造成利福平耐藥的根本原因。其突變的位置發生在507~533 位，由27 個氨基酸組成的區域中。若rpo B 基因編碼區出現點突變、缺失、插入等，則會導致該基因與利福平的親和力降低，從而產生利福平耐藥。然而，LPA 旨在對比基因突變情況進行耐藥性的判斷，其根本機制在于對樣本予以DNA擴增-雜交反應以檢測結核分枝桿菌耐藥基因位點突變狀態，從而判斷結核分枝桿菌耐藥性，該技術具有檢測簡便及快速等優點，因此后期可根據臨床實際情況選擇。由于Genexpert 及LPA 均存在PCR 檢測步驟，因此兩者對耐藥性結核病的診斷效能差異不大。綜上所述，GeneXpert 和LPA 在診斷耐藥結核病中效果相當，后續檢測可根據實際情況選擇，但由于兩者均存在誤診風險，因此還需引入其他檢測方式，為實驗室提供更精準的依據。