附睪精子抗氧化保護(hù)機(jī)制研究進(jìn)展

許嬌霞，張家新

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

精子在睪丸形成后功能還未成熟，在附睪轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中才逐漸獲得受精能力和運(yùn)動(dòng)能力[1]，因此，附睪是精子最后成熟的場(chǎng)所[2]。精子在附睪轉(zhuǎn)運(yùn)的同時(shí)，附睪將含有與精子成熟相關(guān)蛋白的附睪小體分泌到附睪液中并作用于精子。精子在經(jīng)歷一系列的表觀修飾后，染色質(zhì)、質(zhì)膜都將發(fā)生重塑，使得精子逐漸成熟[3]。且附睪上皮分泌的附睪小體中含有多種抗氧化酶可傳遞給精子，保護(hù)其免受氧化損傷[4-5]。

1 附睪精子面臨的氧化應(yīng)激

精子氧化損傷主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過(guò)氧化增加和DNA損傷[7]。由圖1可知，精子代謝異常時(shí)線粒體產(chǎn)生過(guò)量的ROS進(jìn)入細(xì)胞核后，可將鳥苷氧化成8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)，從而引發(fā)DNA突變；而當(dāng)細(xì)胞外ROS過(guò)量時(shí)脂質(zhì)過(guò)氧化增加，其產(chǎn)物羥基壬烯醛(4-HNE)相應(yīng)上升后對(duì)DNA的突變也具有誘導(dǎo)作用[8-11]。Wu等[2]為檢測(cè)氧化應(yīng)激對(duì)附睪精子的影響作用，對(duì)成年大鼠進(jìn)行腹腔注射叔丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)處理，并收集其第3、6和9周附睪尾部的精子，發(fā)現(xiàn)3個(gè)時(shí)期的精子都呈低運(yùn)動(dòng)性和高DNA氧化水平，而且t-BHP造成的氧化應(yīng)激會(huì)對(duì)附睪的功能造成長(zhǎng)期影響，在大鼠經(jīng)t-BHP處理后第9周，其附睪的脂質(zhì)過(guò)氧化依舊處于一個(gè)較高的水平，從而影響到精子成熟，導(dǎo)致精子質(zhì)量較低。據(jù)報(bào)道，人的精子在受到氧化應(yīng)激后，其功能和活力受損，進(jìn)而對(duì)精子的受精過(guò)程造成影響，嚴(yán)重時(shí)則會(huì)導(dǎo)致男性不育[3-14]。而適量的ROS不僅可以保護(hù)精子免受氧化損傷，還對(duì)精子的獲能具有促進(jìn)作用[10-11]，可見(jiàn)附睪中正常生理水平的ROS對(duì)雄性生殖能力至關(guān)重要。

圖1 精子中活性氧的作用通路圖[10-11]Fig.1 Pathway diagram of reactive oxygen species in sperm[10-11]

隨著精子在附睪內(nèi)的運(yùn)行與成熟，其代謝率、形態(tài)、運(yùn)動(dòng)模式都會(huì)發(fā)生改變，使附睪不同部位的精子產(chǎn)生了不同水平的ROS，而此時(shí)精子對(duì)于抗氧化劑的需求也會(huì)隨之發(fā)生改變，以適應(yīng)不同產(chǎn)量的ROS[15]。Rana等[16]報(bào)道，在山羊附睪不同節(jié)段的精子和附睪液中可以檢測(cè)到多種抗氧化酶，附睪液中抗氧化酶的活性從附睪頭到附睪尾逐漸增加，而精子中的趨勢(shì)卻與之相反，這說(shuō)明山羊附睪液為精子提供的抗氧化環(huán)境對(duì)精子具有相應(yīng)的補(bǔ)償作用。因此，附睪中生理水平ROS的維持需要各種抗氧化酶的相互協(xié)調(diào)，從而起到保護(hù)精子使之正常成熟的作用[5]。

2 附睪中的抗氧化酶

在附睪中，將ROS維持在生理水平的抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPXs)以及過(guò)氧化物酶(PRDXs)等，各種抗氧化酶清除的ROS類型以及產(chǎn)物見(jiàn)圖2。以下將對(duì)抗氧化物酶在附睪中的作用進(jìn)行闡述。

圖2 重要抗氧化劑的作用通路[17]Fig.2 Pathway diagram of important antioxidants[17]

2.1 超氧化物歧化酶

有報(bào)道表明，SOD在維持精子活力以及功能方面具有重要作用，Aitken等[19]對(duì)高活力精子與異常精子SOD活性檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，SOD活性與氧化損傷程度呈正相關(guān)，而且在大鼠附睪中SOD的活性還會(huì)隨年齡的增長(zhǎng)而降低[20]。另外，一些精子DNA完整性較差的患者可通過(guò)口服SOD抗氧化劑使其癥狀得以改善[21]。由此可見(jiàn)，SOD對(duì)精子DNA完整性具有重要的保護(hù)作用。

2.2 過(guò)氧化氫酶

CAT是一種含血紅素的酶，通過(guò)使用鐵(Fe)或錳(Mn)輔助因子，將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2。在大多數(shù)真核細(xì)胞中，CAT在過(guò)氧化物酶體中的濃度最高，在線粒體和胞漿中濃度較低。Jemec等[22]認(rèn)為,CAT在某種程度上起輔助GPXs的作用。通過(guò)對(duì)人紅細(xì)胞使用放射性標(biāo)記和氨基三唑抑制后發(fā)現(xiàn)，CAT可清除50%的H2O2，而GPXs和谷胱甘肽還原酶(GSH)則負(fù)責(zé)清除另一半[23]。

然而，CAT在兔[24]、小鼠[25]、牛[26]、水牛[27]、豬[28]的精子中并不存在，但在人[29]、大鼠[30]精子中有較低水平表達(dá)，Jean-fran?ois等[26]和Kar等[27]還發(fā)現(xiàn)CAT在牛精液中含量很高。Kumar等[31]在山羊附睪不同部位的附睪液和精子中也未檢測(cè)到CAT的活性。表明不同物種的精子與附睪中CAT的作用機(jī)制存在較大差異。此外，Wu等[12]通過(guò)使用t-BHP處理大鼠附睪以驗(yàn)證CAT對(duì)附睪中ROS的清除能力發(fā)現(xiàn)，大鼠附睪任何部位中的CAT表達(dá)水平均不會(huì)隨t-BHP的處理而改變。說(shuō)明CAT似乎并不是大鼠附睪中抵御氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶。但對(duì)于其他動(dòng)物是否也如此仍需進(jìn)一步的研究。

2.3 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶

GPXs可將脂質(zhì)氫過(guò)氧化物(ROOH)還原為相應(yīng)的醇，并將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O。到目前為止，在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)報(bào)道了8種GPXs(GPX1-8)的基因亞型，這些基因在哺乳動(dòng)物不同器官中廣泛分布[32-33]。有報(bào)道表明，當(dāng)給雄性大鼠服用谷胱甘肽合成酶抑制劑(BSO)后，附睪尾精子抗氧化能力下降，繼而使染色質(zhì)質(zhì)量受損[34]。這些研究表明GPXs在精子成熟過(guò)程中的保護(hù)作用至關(guān)重要[2,5]。

在GPXs家族中，GPX1-4的活性依賴于硒，其中GPX4是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白[35]，在精子線粒體中含量非常豐富(約占精子中段蛋白的50%)，而當(dāng)其缺失時(shí)則會(huì)導(dǎo)致男性不育[36]。GPX4的核形式(nGPX4)有助于維持精子染色質(zhì)的穩(wěn)定性，但敲除nGPX4基因的雄性小鼠仍具備生育能力[37]。GPXs家族的另一成員GPX5，其活性不依賴于硒[32]，由附睪上皮的主細(xì)胞分泌，與位于細(xì)胞質(zhì)中GPX1、GPX3和GPX4的低表達(dá)量相反[38]，GPX5在附睪頭中高度表達(dá)，而且受雄激素的調(diào)控[39]，可以保護(hù)精子DNA免受氧化損傷[33]。敲除GPX5的雄性成年小鼠(3個(gè)月～1歲)，其精子的DNA氧化水平高于野生型對(duì)照，敲除GPX5后雖然具備生育能力并可以產(chǎn)生正常的后代，但隨著這些雄性小鼠年齡的增長(zhǎng)，其幼崽中流產(chǎn)、圍產(chǎn)期死亡及具有不同程度發(fā)育缺陷的異常生殖現(xiàn)象都有所增加[32-33]。這表明附睪中GPX5對(duì)于精子的抗氧化保護(hù)作用具有重要意義。Vilagran等[40]發(fā)現(xiàn)，豬新鮮精液中的精子質(zhì)量較低時(shí)，機(jī)體會(huì)通過(guò)升高精漿中GPX5的濃度發(fā)起補(bǔ)償機(jī)制來(lái)保護(hù)精子，且精漿中GPX5的含量對(duì)人工授精母豬的產(chǎn)仔數(shù)有積極影響[41]。Williams等[42]發(fā)現(xiàn)，GPX5能夠防止精子過(guò)早地發(fā)生頂體反應(yīng)。作者所在研究團(tuán)隊(duì)在對(duì)綿羊附睪抗氧化功能的研究中發(fā)現(xiàn)，在綿羊正常生理?xiàng)l件下，不論是在附睪不同部位的組織、管腔液還是精子中，從附睪頭至附睪尾，GPX5的表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)，但隨著精子在附睪的轉(zhuǎn)運(yùn)，精子上GPX5的分布卻越來(lái)越廣泛，儲(chǔ)存至附睪尾部的成熟精子在核后帽、頸部、線粒體鞘、以及精子尾部均有GPX5的分布(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。此外，大鼠精子的免疫熒光結(jié)果顯示，精漿中GPX5在附睪轉(zhuǎn)運(yùn)和射精過(guò)程中結(jié)合到精子頭部[42]。總之，在哺乳動(dòng)物各階段，精子抵御氧化損傷時(shí)，GPXs都起著重要的核心作用[5,15,33]。

2.4 過(guò)氧化物酶

PRDXs是一個(gè)抗氧化酶家族，從酵母到人類都高度表達(dá)。其活性位點(diǎn)含有1或2個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基，在氧化還原過(guò)程中參與分子二硫鍵交聯(lián)，這對(duì)它們的抗氧化功能至關(guān)重要[43]。根據(jù)活性位點(diǎn)上Cys殘基的數(shù)量，PRDXs亞型分為2-Cys PRDXs (PRDX1-5)和1-Cys PRDX (PRDX6)[44]，它們的過(guò)氧化物酶活性受其活性部位Cys殘基的氧化狀態(tài)調(diào)節(jié)。PRDXs在附睪頭和附睪尾的主細(xì)胞、基細(xì)胞以及窄細(xì)胞中高表達(dá)，但在透明細(xì)胞中不表達(dá)[17]。這些酶是精子中重要的抗氧化劑，可以降低過(guò)氧化物(H2O2和有機(jī)氫過(guò)氧化物)和ONOO-等ROS的水平，以避免細(xì)胞受到氧化損傷[45-46]。當(dāng)活性中心Cys被氧化(硫醇氧化)變得無(wú)活性時(shí)[44]，如果ROS水平進(jìn)一步增加，PRDXs就會(huì)被過(guò)度氧化，并形成含有PRDX-SO2的高分子復(fù)合物[47]。因此，PRDXs須還原Cys殘基才能繼續(xù)清除ROS。 其中，PRDX1-5的氧化形式可以通過(guò)硫氧還蛋白(TRX)/硫氧還蛋白還原酶(TRD)/NADPH系統(tǒng)恢復(fù)到其活性狀態(tài)，PRDX1-5的過(guò)氧化形式則可以通過(guò)硫氧還原蛋白(SRX)或sestrins用ATP和GSH還原(圖3A)。而在PRDX6被氧化為PRDX6-SOH的情況下，谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GSTpi)和GSH可以通過(guò)還原其活性位點(diǎn)的氧化硫醇來(lái)恢復(fù)其活性。然而，PRDX6的過(guò)氧化形式PRDX6-SO2卻不能被再次還原，將永久失活不可逆[48](圖3B)。

圖3 PRDX1-5(A)和PRDX6(B)的活化機(jī)制[17]Fig.3 Activation mechanism of PRDX1-5 (A) and PRDX6(B)[17]

在PRDXs家族中，PRDX6是被研究較多的一個(gè)酶，它是一種具有過(guò)氧化物酶和鈣非依賴性磷脂酶A2(iPLA2)活性的雙重酶，可防止脂質(zhì)過(guò)氧化和修復(fù)氧化膜[49]。基于PRDX6基因敲除動(dòng)物模型的研究表明，在附睪中缺乏PRDX6的精子出現(xiàn)異常成熟的跡象[48]，且與野生型對(duì)照相比，產(chǎn)仔數(shù)和窩產(chǎn)仔數(shù)均降低[50]。這樣的低生育能力與缺乏PRDX6所導(dǎo)致的精子活力受損、DNA氧化、精蛋白水平降低以及DNA致密化有關(guān)[5,47]，而且這種現(xiàn)象會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而加劇[51]。Liu等[52]通過(guò)給大鼠腹腔注射t-BHP來(lái)模擬氧化應(yīng)激，2周后收集附睪組織和精子發(fā)現(xiàn)，經(jīng)處理后的精子PRDX1和PRDX6水平升高，由于精子不能合成蛋白質(zhì)，因此推測(cè)精子中PRDXs含量增加是由附睪上皮分泌含有PRDXs的附睪小體轉(zhuǎn)移到了精子上引起的。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，附睪上皮在對(duì)抗氧化應(yīng)激時(shí)，除了大量表達(dá)PRDX1和PRDX6外，同時(shí)還會(huì)通過(guò)直接分泌的方式進(jìn)入附睪液中保護(hù)精子抵抗氧化應(yīng)激[48]。這些研究表明附睪中PRDXs的抗氧化作用對(duì)于附睪成熟過(guò)程中的精子具有重要的保護(hù)作用。

3 小 結(jié)

精子在附睪轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)生的一系列變化，增加了其對(duì)高水平ROS的敏感性，而當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致精子脂質(zhì)過(guò)氧化增加和DNA的損傷，因此附睪中各抗氧化酶家族對(duì)成熟過(guò)程中的精子具有重要意義。目前，附睪中各類抗氧化酶家族如何協(xié)同發(fā)揮作用以將ROS維持在生理水平并不清楚，這仍需進(jìn)一步研究，以闡明附睪精子的抗氧化保護(hù)機(jī)制。