重組動(dòng)物皰疹病毒活載體疫苗的構(gòu)建與應(yīng)用研究進(jìn)展

楊明珠，陳曉春，宋佳誠(chéng)，侯亞欣，李俊平

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

在集約化養(yǎng)殖模式下，免疫是動(dòng)物疫病防控的有效手段。疫苗作為免疫防控的最主要物質(zhì)，安全、有效、質(zhì)量可控是其應(yīng)具備的最重要的特性。經(jīng)濟(jì)動(dòng)物使用的疫苗還要考慮其生產(chǎn)工藝、成本、使用的方便性等，最好是多聯(lián)多價(jià)，以減少免疫次數(shù)、節(jié)約人力成本等。活疫苗具有成本低、免疫效果好的優(yōu)點(diǎn)，但有的微生物不易致弱，或致弱后易引起毒力返強(qiáng)，存在安全風(fēng)險(xiǎn)，不宜制備活疫苗。滅活疫苗雖無(wú)毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，但制備成本較高、免疫效果相對(duì)較差，有的微生物制備成滅活疫苗甚至無(wú)免疫保護(hù)作用。同時(shí)大多數(shù)傳染性病原體是通過(guò)黏膜進(jìn)入宿主體內(nèi)，因此除了傳統(tǒng)誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫的注射疫苗外,還應(yīng)該開(kāi)發(fā)能誘導(dǎo)黏膜免疫的疫苗,從而在黏膜侵入點(diǎn)建立第一道防線,阻止病原體侵入機(jī)體[1]。重組活載體疫苗是利用重組DNA技術(shù)將外源性目的基因插入到載體基因組中并獲得高效表達(dá)，同時(shí)又不影響原毒株的復(fù)制，且能誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫與細(xì)胞免疫，甚至是黏膜免疫[2]，有效規(guī)避了傳統(tǒng)活疫苗和滅活疫苗的一些缺點(diǎn)，達(dá)到一針多防的效果。目前用來(lái)構(gòu)建活載體的動(dòng)物病毒主要有痘病毒[3-5]、腺病毒[6-7]、皰疹病毒[8]、不分節(jié)段的單股RNA病毒[9]等，其中，皰疹病毒因基因組大、宿主范圍廣泛、含有多個(gè)復(fù)制非必需區(qū)及相關(guān)基因操作技術(shù)成熟而成為大多數(shù)研究者選擇的載體病毒。用作病毒載體的動(dòng)物皰疹病毒主要有火雞皰疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、鴨瘟病毒(Duck enteritis virus,DEV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)等。皰疹病毒基因組中的有些基因與病毒的毒力有關(guān)而不參與病毒的復(fù)制，通過(guò)缺失或失活相關(guān)毒力基因會(huì)在不同程度上降低病毒的毒力，由此可構(gòu)建出弱毒疫苗對(duì)載體相關(guān)病毒引起的疾病進(jìn)行有效防控，同時(shí)插入外源基因的重組病毒所表達(dá)的蛋白可正常進(jìn)行翻譯、加工與修飾，保證了重組活載體疫苗良好的免疫原性[10]。筆者從重組皰疹病毒的構(gòu)建方法、外源基因的表達(dá)方式及插入位點(diǎn)的篩選、重組皰疹病毒活載體疫苗的研究、重組活載體疫苗的應(yīng)用及展望等幾方面進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 重組皰疹病毒的構(gòu)建方法

1.1 傳統(tǒng)同源重組法

基于同源重組的原理來(lái)構(gòu)建基因缺失病毒或重組病毒的技術(shù)路線分為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建與重組病毒的篩選這2個(gè)步驟。通常是先利用PCR技術(shù)以病毒基因組為模板擴(kuò)增用作重組同源臂的2個(gè)基因片段，而后將外源基因表達(dá)盒插入同源臂之間，構(gòu)建含有外源基因表達(dá)盒及左右同源臂的轉(zhuǎn)移載體，利用轉(zhuǎn)移載體與親本株在真核易感細(xì)胞內(nèi)同時(shí)培養(yǎng)發(fā)生同源重組而達(dá)到基因的缺失或替換。其中一種重組方法是在親本病毒株感染真核細(xì)胞后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移載體的轉(zhuǎn)染，這種重組效率低，且不易對(duì)重組毒株和親本毒株進(jìn)行分離，篩選純化的時(shí)間長(zhǎng)[11]。目前常采用轉(zhuǎn)移載體與親本毒基因組共轉(zhuǎn)染的方法，利用轉(zhuǎn)移載體上攜帶的報(bào)告基因進(jìn)行重組病毒的蝕斑篩選，一般經(jīng)3～5代篩選即可獲得具有感染活性的重組病毒[12]。時(shí)慶賀等[13]通過(guò)DNA體外重組技術(shù)構(gòu)建出含有豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)YY株ORF2基因和細(xì)胞因子佐劑IL-2基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，將其與rPRV-gE-/TK-/EGFP+的基因組共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+。Andoh等[14]通過(guò)體外克隆技術(shù)將含有傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2基因的表達(dá)盒插入到含有不同同源臂的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中，并將其與HVT共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，基于同源重組將IBDV的VP2基因成功插入到HVT基因組中UL3-4、UL22-23、UL45-46和US10-SORF3這4個(gè)位點(diǎn)，成功構(gòu)建出4株重組病毒。

同源重組技術(shù)不僅在早期病毒構(gòu)建過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，更是與時(shí)俱進(jìn)地與新興技術(shù)相結(jié)合形成更高效的重組病毒構(gòu)建方法，如CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組技術(shù)[15]、Red/ET重組技術(shù)[16]等。

1.2 基于病毒細(xì)菌人工染色體(BAC)平臺(tái)的構(gòu)建方法

隨著對(duì)大型基因組序列分析的需求越來(lái)越多，對(duì)高裝載量載體的開(kāi)發(fā)技術(shù)逐漸發(fā)展，目前已開(kāi)發(fā)出多種類(lèi)型的人工染色體載體，其中包括基于大腸桿菌性因子F質(zhì)粒構(gòu)建的BAC系列，其裝載量為50～300 kb，目前已被廣泛用于大基因組病毒的克隆。人工構(gòu)建的BAC載體質(zhì)粒拷貝數(shù)低，但穩(wěn)定性好，同時(shí)在真核細(xì)胞中基于BAC表達(dá)的基因能接近生理性表達(dá)[17]。

構(gòu)建病毒BAC是對(duì)病毒基因組進(jìn)行修飾、獲得重組病毒的前提。在含有病毒BAC的大腸桿菌中對(duì)病毒基因組進(jìn)行快速缺失、突變及插入特定序列等基因修飾非常方便，可利用Red/ET重組技術(shù)來(lái)改造大腸桿菌中的BAC[16]。一般可分為兩步進(jìn)行，第一步是構(gòu)建帶有標(biāo)記基因及兩端含有同源臂序列的表達(dá)盒，將其電轉(zhuǎn)化含有病毒BAC的感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗性篩選及PCR鑒定等獲得正確的重組子；第二步是構(gòu)建帶有外源基因及兩端含有同源臂序列的表達(dá)盒，利用電轉(zhuǎn)化方式將其導(dǎo)入含有重組子的感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)反向抗性篩選獲得刪除了標(biāo)記基因的重組子。除了利用抗藥性篩選法，還可利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法，將半乳糖激酶(Galk)基因作為篩選基因，在重組過(guò)程中通過(guò)觀察細(xì)菌能否在只含有半乳糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)來(lái)判斷是否重組成功。

基于RecA系統(tǒng)或利用Red/ET重組技術(shù)同樣能進(jìn)行病毒BAC的修飾，兩者的修飾技術(shù)相似，都是在體外構(gòu)建含有標(biāo)記基因或外源基因的DNA分子，將其與大腸桿菌內(nèi)的病毒BAC進(jìn)行重組，但在RecA系統(tǒng)中為了誘發(fā)重組酶的表達(dá)，同源臂長(zhǎng)度是Red/ET系統(tǒng)的十余倍。陳柳等[18]在DEV疫苗株細(xì)菌人工染色體克隆pDEV-EF1的基礎(chǔ)上，將5個(gè)重組表達(dá)框分別通過(guò)Red/ET兩步重組技術(shù)克隆至pDEV-EF1突變體的US7和US8基因之間，構(gòu)建了攜帶不同啟動(dòng)子調(diào)控的Es突變體克隆pDEV-pro-Es。

Cre/loxP重組酶系統(tǒng)也被廣泛用于基因修飾。Cre/loxp重組酶系統(tǒng)包括Cre重組酶和重組酶的識(shí)別位點(diǎn)loxP，Cre重組酶不需要其他輔助因子就能完成活體內(nèi)和體外細(xì)胞中的DNA重組，且重組效率高達(dá)80%，遠(yuǎn)高于其他重組酶，通過(guò)特異性識(shí)別基因組上的2個(gè)34 bp長(zhǎng)度的loxP位點(diǎn)，從而對(duì)位點(diǎn)之間的基因序列進(jìn)行修飾。此外，由于Cre重組酶對(duì)loxP位點(diǎn)的序列突變具有一定的包容性，大大增加了該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。但就本質(zhì)而言Cre/loxP并非真正意義上的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，因?yàn)樽鳛橹亟M事件所必需的順式元件loxP位點(diǎn)需人工導(dǎo)入，而導(dǎo)入過(guò)程仍需借助同源重組程序。同時(shí)由Cre重組酶介導(dǎo)的整合和刪除反應(yīng)是可逆的，敲除的靶基因有可能重新返回原來(lái)的位點(diǎn)，整合的基因也同樣可能從整合位點(diǎn)掉下來(lái)。朱佳[19]以IBDV XD2010超強(qiáng)毒株為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增其VP2基因,利用HVT FC126疫苗株基因組US2同源序列、CMV啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白(EGFP)基因,構(gòu)建含有VP2基因的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pCMV-EGFP-VP2，經(jīng)轉(zhuǎn)染、純化得到帶EGFP基因的重組病毒rHVT-EGFP-VP2，并利用Cre重組酶去除rHVT-EGFP-VP2基因組中的EGFP基因,重新轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，經(jīng)篩選、純化得到不含EGFP基因的重組病毒rHVT-VP2。

目前已成功構(gòu)建出PRV BAC[20]、HVT BAC[21]等，基于病毒BAC平臺(tái)對(duì)病毒基因組進(jìn)行遺傳修飾，簡(jiǎn)化了重組病毒的構(gòu)建，有效且可靠。

1.3 基于Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建方法

利用傳統(tǒng)同源重組方法獲得重組病毒的效率低，將皰疹病毒全基因組與BAC質(zhì)粒進(jìn)行連接，在電轉(zhuǎn)化過(guò)程中往往會(huì)出現(xiàn)片段缺失，也會(huì)影響重組病毒的獲得效率。通過(guò)構(gòu)建病毒基因組Fosmid文庫(kù)，在細(xì)菌中對(duì)龐大的皰疹病毒基因組進(jìn)行基因的缺失、插入或突變，能極大提升獲得病毒突變體的效率。

構(gòu)建皰疹病毒Fosmid文庫(kù)首先需將病毒龐大的基因組隨機(jī)剪切成各個(gè)片段，而后將各片段末端補(bǔ)平修飾后與平末端的Fosmid載體連接，經(jīng)體外噬菌體包裝蛋白包裝后侵染大腸桿菌，經(jīng)抗性篩選后挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定及質(zhì)粒提取，構(gòu)建出涵蓋皰疹病毒全基因組的Fosmid文庫(kù)。選取包含病毒全長(zhǎng)基因組的質(zhì)粒組合共轉(zhuǎn)染病毒易感的真核細(xì)胞，待產(chǎn)生細(xì)胞病變后收毒。外源基因一般通過(guò)基因工程技術(shù)導(dǎo)入到含有皰疹病毒基因片段的Fosmid質(zhì)粒中，通過(guò)各片段之間的重組從而將外源基因?qū)氲讲《净蚪M中。

李奇蒙等[22]利用Gateway LR克隆技術(shù)將含有IBDVVP2基因的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pENTR-VP2與構(gòu)建的重組黏粒f5354ccdBK+共同參與基因片段互換反應(yīng)，構(gòu)建重組黏粒f5354-VP2，將該重組黏粒與其他4個(gè)相互重疊覆蓋HVT全基因組的黏粒經(jīng)酶切線性化后共同轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞,成功拯救出重組病毒rHVT-VP2。吳紅霞[23]成功構(gòu)建了中國(guó)PRV經(jīng)典毒株SC株的Fosmid文庫(kù)，并利用PRV SC株的Fosmid文庫(kù)成功拯救出重組病毒，同時(shí)結(jié)合Red/ET所介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，構(gòu)建了在PRV SC的UL36基因N-端插入EGFP報(bào)告基因的重組病毒rPRVSC-UL6-EGFP。Abid等[24]利用實(shí)驗(yàn)室已建立的PRV Fosmid文庫(kù)平臺(tái)，構(gòu)建了gE/gI/TK基因缺失且共表達(dá)豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因和PCV2 Cap蛋白的重組PRV。

基于病毒基因組Fosmid文庫(kù)插入的外源基因片段較小，但Fosmid文庫(kù)具有穩(wěn)定性好、沒(méi)有偏向性、構(gòu)建周期短及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，為快速構(gòu)建突變病毒提供了良好的平臺(tái)。

1.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)是基于核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白識(shí)別導(dǎo)向性RNA(gRNA)從而對(duì)基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行精確切割，誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，細(xì)胞隨之利用非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HR)方式對(duì)切割位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)DNA水平基因敲除或精確編輯。與之前的ZFNs和TALENs基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅需sgRNA便可對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行修飾，可極大地降低成本、縮短時(shí)間[25]，同時(shí)也可與其他基因敲除技術(shù)結(jié)合使用，如λ-Red同源重組技術(shù)[26]等。在實(shí)際操作中，首先需針對(duì)特定位點(diǎn)設(shè)計(jì)出sgRNA，將其退火成雙鏈后與含有Cas9蛋白基因的載體通過(guò)酶切連接構(gòu)成CRISPR/Cas9復(fù)合體，將其與含有外源基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒及病毒基因組共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，Cas9蛋白通過(guò)識(shí)別與sgRNA互補(bǔ)結(jié)合的DNA鏈進(jìn)行切割形成DNA雙鏈斷裂，細(xì)胞隨之對(duì)斷裂處進(jìn)行修復(fù)，從而進(jìn)行特定位點(diǎn)的缺失或替換。

經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，切割部位依照同源重組的方式進(jìn)行修復(fù)的概率不足10%，因此，研究者將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與同源重組結(jié)合起來(lái)，使用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒將同源序列轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，在提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)精確修復(fù)率的同時(shí)又能改善同源重組技術(shù)效率低等問(wèn)題。張華偉等[15]采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組技術(shù)對(duì)分離到的PRV HB2017株進(jìn)行基因編輯，并利用蝕斑純化等方法成功獲取基因缺失株。白銀榮[27]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立了HVT的載體平臺(tái)，并拯救獲得在US2或US10基因內(nèi)表達(dá)外源基因的重組HVT。 Chang等[28]首先針對(duì)HVT的UL45-46基因間區(qū)域合成了sgRNA，將其克隆到質(zhì)粒pX459-v2中，并利用基因特異性引物擴(kuò)增H7N9亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) HA或EGFP的完整編碼區(qū)，分別將其克隆到供體質(zhì)粒pHVT-UL45-46中，將pX459-v2與供體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，在感染后72 h收集轉(zhuǎn)染產(chǎn)物并進(jìn)行噬斑純化，最終成功構(gòu)建出表達(dá)H7N9亞型AIV HA蛋白的重組毒株HVT-H7N9 HA。

以上常用來(lái)構(gòu)建重組皰疹病毒的各個(gè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 重組皰疹病毒構(gòu)建方法的優(yōu)缺點(diǎn)

2 外源基因的表達(dá)方式及插入位點(diǎn)的篩選

在對(duì)重組病毒活載體疫苗進(jìn)行效能評(píng)價(jià)時(shí)，外源基因的表達(dá)效果是重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟，轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的限速步驟，選擇可調(diào)控的啟動(dòng)子和相關(guān)調(diào)控序列是構(gòu)建一個(gè)良好表達(dá)系統(tǒng)的前提。外源基因的表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)包含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、Kozac序列和終止密碼子等。同其他DNA病毒一樣,皰疹病毒表達(dá)量的高低主要取決于上游啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，一般選用強(qiáng)啟動(dòng)子[29]。同時(shí)外源基因的高效表達(dá)還與細(xì)胞內(nèi)基因的拷貝數(shù)密切相關(guān)，隨著拷貝數(shù)的增加，蛋白的表達(dá)量也會(huì)逐步升高[1]。改變宿主細(xì)胞的特性如延長(zhǎng)細(xì)胞周期、提高細(xì)胞內(nèi)蛋白糖基化水平等也可促進(jìn)外源蛋白的表達(dá)。

構(gòu)建重組PRV所選用的主要是gG和gE啟動(dòng)子，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特且活性較強(qiáng)，還有g(shù)D和CMV等啟動(dòng)子，一般是啟動(dòng)子序列距外源基因起始密碼子越近表達(dá)效果越好[30]。不同啟動(dòng)子對(duì)外源基因表達(dá)的影響不同，陳柳等[18]為了探討不同啟動(dòng)子對(duì)鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)E基因C-端截短形式E451-dk(Es)在DEV載體中表達(dá)的影響，選取pCAG、pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)這5種啟動(dòng)子通過(guò)常規(guī)基因克隆的方法替換pCMV啟動(dòng)子，經(jīng)生物學(xué)特性分析得出啟動(dòng)子pRSV活性最強(qiáng)，Es在pRSV的調(diào)控下表達(dá)量最高。

為驗(yàn)證外源基因是否成功表達(dá)，需將體外試驗(yàn)與體內(nèi)試驗(yàn)相結(jié)合。Abid等[24]首先利用Fosmid文庫(kù)平臺(tái)構(gòu)建了共表達(dá)CSFV E2蛋白和PCV2 Cap蛋白的gE/gI/TK三基因缺失重組PRV，其遺傳穩(wěn)定及生長(zhǎng)特性與親本株無(wú)差別，通過(guò)家兔和豬的免疫評(píng)價(jià)結(jié)果表明，該重組株對(duì)家兔和豬是安全的，且從免疫后家兔和豬的血清中均能檢測(cè)出抗PRV的抗體，但未能檢測(cè)到抗CSFV和PCV2的抗體，推測(cè)是由于插入外源基因的位置不合適，或E2和Cap蛋白的表達(dá)量太低不足以誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。

一直以來(lái)，研究者們?cè)谶x擇外源基因的插入位點(diǎn)時(shí)，首先考慮病毒的復(fù)制非必需區(qū)域，雖然皰疹病毒的基因組序列含有大量的復(fù)制非必需區(qū)，但這些區(qū)域與病毒的毒力、病毒的免疫逃避機(jī)制或是宿主范圍關(guān)系等基礎(chǔ)理論還有待進(jìn)一步研究，同時(shí)外源基因在載體上的表達(dá)既受到表達(dá)載體啟動(dòng)子的影響，又受到外源基因在插入過(guò)程中所引起的插入位點(diǎn)效應(yīng)的影響。皰疹病毒載體的常用插入位點(diǎn)及相關(guān)重組信息見(jiàn)表2。

表2 皰疹病毒載體的常用插入位點(diǎn)及相關(guān)重組信息

續(xù)表

3 重組皰疹病毒活載體疫苗研究進(jìn)展

3.1 以HVT為載體構(gòu)建的重組病毒活疫苗

3.2 以PRV為載體構(gòu)建的重組病毒活疫苗

近年來(lái)，隨著對(duì)PRV分子生物學(xué)研究的深入，其作為重組病毒表達(dá)載體的類(lèi)型越來(lái)越豐富，單毒力基因缺失及多毒力基因共缺失株的構(gòu)建為疫苗株的安全性提供了保障，并通過(guò)多種成熟的重組技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了將多種豬的重大疫病病毒抗原基因作為外源基因成功插入到PRV的非必需區(qū)。Feng等[56]利用同源重組技術(shù)將非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的CD2V基因插入到TK、gE、gI基因缺失的PRV基因組中，獲得重組毒株P(guān)RV-ΔgE/ΔgI/ΔTK-(CD2V)。經(jīng)試驗(yàn)證明了其遺傳穩(wěn)定性、毒力、免疫原性和保護(hù)能力，為非洲豬瘟疫苗的有效研發(fā)奠定了基礎(chǔ)；毛汐語(yǔ)等[38]利用同源重組技術(shù)構(gòu)建共表達(dá)豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白和豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)VP7蛋白的偽狂犬三聯(lián)基因工程疫苗株，結(jié)果顯示該重組株外源基因穩(wěn)定存在，毒力基因穩(wěn)定缺失，增殖特性差異不大，為PRV、PEDV和PoRV基因工程三聯(lián)苗研究奠定了基礎(chǔ)。

目前，PCV2的Cap蛋白基因作為外源基因插入到PRV基因組的PK-gG基因之間[37]、UL22-UL24基因之間[31]、US3-US6基因之間[39]等，經(jīng)PCR鑒定及間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)等驗(yàn)證了重組病毒的成功構(gòu)建，但重組病毒的免疫原性卻參差不齊，這可能與表達(dá)盒的啟動(dòng)子及插入位點(diǎn)有關(guān)；同樣成功插入到PRV基因組中的還有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HPPRRSV)GP5基因[40]、CSFVE2基因[41]、豬細(xì)小病毒(Procine parvovirus，PPV)VP2基因[57]等，構(gòu)建出的重組病毒經(jīng)一系列生物學(xué)特性分析證明了其穩(wěn)定性、有效性與安全性，為相應(yīng)基因工程疫苗的研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3.3 以DEV為載體構(gòu)建的重組病毒活疫苗

隨著對(duì)DEV基因結(jié)構(gòu)與功能認(rèn)識(shí)的不斷深入，大量的毒力基因、保護(hù)性抗原基因和復(fù)制非必需基因已得到分析鑒定,常被用作水生家禽疫苗研制中的病毒載體。

Niu等[58]通過(guò)構(gòu)建DEV C-KCE疫苗株的Fosmid文庫(kù)，在病毒感染性克隆的基礎(chǔ)上，將鴨甲型1型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV-1)的VP0基因插入疫苗株DEV C-KCE基因組的UL41區(qū)，構(gòu)建了重組病毒rDEV-UL41VP0。分析得知VP0基因在被感染的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，且不影響DEV C-KCE在細(xì)胞中的復(fù)制。重組病毒對(duì)DEV致死株CSC的攻毒保護(hù)率達(dá)100%，對(duì)DHAV-1 161/79提供70%的保護(hù)；王波等[43]同樣通過(guò)構(gòu)建DEV的Fosmid文庫(kù)，將H5亞型AIV 2.3.2.1d分支代表病毒CK/LN/SD007株的HA基因插入DEV基因組中，構(gòu)建了重組病毒rDEV H5-12，經(jīng)試驗(yàn)證明了其良好的穩(wěn)定性、生長(zhǎng)特性及免疫原性；陳柳等[44]在DEV疫苗株細(xì)菌人工染色體克隆pDEV-EF1的基礎(chǔ)上，利用Red/ET兩步重組法將密碼子優(yōu)化的小鵝瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)的VP2基因框插入到DEV的US7和US8基因之間，獲得了重組病毒rDEV-VP2和刪除Bac質(zhì)粒序列的rDEV-VP2-Cre。對(duì)重組病毒進(jìn)行體內(nèi)外一系列生物學(xué)特性分析得出重組毒株生長(zhǎng)特性與親本株基本一致，且能誘導(dǎo)鴨產(chǎn)生GPV VP2的特異性抗體；Ding等[45]構(gòu)建了2株分別表達(dá)NDV F蛋白(rDEV-F)和HN蛋白(rDEV-HN)的重組DEV，經(jīng)評(píng)估得出這2株重組DEV在SPF雞中的保護(hù)功效不同，經(jīng)rDEV-F免疫后的雞能對(duì)致死性NDV產(chǎn)生100%的抵抗力，而rDEV-HN沒(méi)有誘導(dǎo)有效的保護(hù)。

3.4 以ILTV為載體構(gòu)建的重組病毒活疫苗

ILTV與其他皰疹病毒相比，在基因組結(jié)構(gòu)、宿主范圍及侵入途徑等方面存在特異性，目前對(duì)于ILTV的研究熱點(diǎn)著重于毒株的分離與鑒定，以及將ILTV的有效免疫蛋白VP2基因作為外源基因插入到合適的病毒載體中，如雞痘病毒、桿狀病毒、腺病毒及NDV等。

以ILTV為載體構(gòu)建重組病毒時(shí)，可根據(jù)基因同源關(guān)系的差異，選擇與ILTV差異大且抗原性強(qiáng)的病毒基因。Shao等[51]經(jīng)同源重組技術(shù)將NDV F蛋白基因插入到US9基因缺失的ILTV基因組中，得到重組毒ILTV-ΔUS9-F。并經(jīng)試驗(yàn)證明ILTV-ΔUS9-F的生長(zhǎng)特性與親本病毒相似，且F基因能穩(wěn)定存在于ILTV-ΔUS9-F的基因組中并穩(wěn)定表達(dá)。動(dòng)物感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，ILTV-ΔUS9-F對(duì)SPF雞無(wú)致病性，且單次免疫后即可對(duì)ILTV強(qiáng)毒株和中國(guó)流行的基因Ⅶ型及經(jīng)典基因Ⅸ型NDV強(qiáng)毒株的攻擊提供有效的保護(hù)，且與現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的NDV商品化活疫苗相比，ILTV-ΔUS9-F能更好地抑制基因Ⅶ型NDV感染后的復(fù)制和排毒。

4 重組活載體疫苗的應(yīng)用

隨著基因工程技術(shù)的愈發(fā)成熟，重組病毒構(gòu)建研究越來(lái)越多，大量重組病毒構(gòu)建工作經(jīng)驗(yàn)逐漸累積，相關(guān)生物制品成功研制并且應(yīng)用。筆者統(tǒng)計(jì)了部分已注冊(cè)的重組皰疹病毒活載體疫苗的相關(guān)生物制品(表3)，包括HVT、DEV、PRV、ILTV的相關(guān)活疫苗、滅活疫苗等，以及部分具有專(zhuān)利權(quán)保護(hù)的重組皰疹病毒(表4)，包括以HVT、DEV、PRV、ILTV為載體構(gòu)建的相關(guān)重組病毒等。

表3 部分已注冊(cè)的重組皰疹病毒活載體疫苗的相關(guān)生物制品

表4 具有專(zhuān)利權(quán)保護(hù)的部分重組皰疹病毒

續(xù)表

5 小結(jié)和展望

基因工程活載體疫苗作為一類(lèi)新型疫苗，有效地規(guī)避了傳統(tǒng)疫苗的缺陷，簡(jiǎn)化了養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的免疫程序，提高了疫病防控工作效率。隨著研究的深入，研究者們?cè)趶V泛應(yīng)用同源重組技術(shù)的同時(shí)，BAC技術(shù)、Fosmid文庫(kù)和CRISPR/Cas9技術(shù)等也被應(yīng)用于重組病毒的構(gòu)建，大大提高了重組病毒活載體疫苗的研發(fā)效率。除了皰疹病毒，同樣經(jīng)常被用作重組病毒活載體的病毒還有痘病毒、腺病毒及NDV等,這更加凸顯了重組病毒活載體疫苗在研制效率及免疫效果方面的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。

但隨著重組活載體疫苗的大量研發(fā)，某些問(wèn)題也逐漸被重視，免疫原基因的選擇及如何保證重組病毒的遺傳穩(wěn)定性和安全性也需著重研究。在進(jìn)行免疫原基因的選擇時(shí)，不能單一地只考慮其免疫原性，其表達(dá)效率及對(duì)動(dòng)物的安全性同樣應(yīng)作為選擇依據(jù)。目前，重組病毒的遺傳穩(wěn)定性一般是通過(guò)細(xì)胞傳代試驗(yàn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室鑒定及基因組測(cè)序分析得到，這種傳統(tǒng)方法準(zhǔn)確率高但耗時(shí)長(zhǎng)，因此，亟需一種新的方法來(lái)快速衡量重組病毒的穩(wěn)定性。而重組病毒安全性一般是經(jīng)臨床動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)實(shí)時(shí)記錄靶動(dòng)物接種合適劑量的病毒之后的各項(xiàng)生命體征指標(biāo)來(lái)間接反映重組病毒的安全性，雖然在當(dāng)前重組動(dòng)物皰疹病毒活載體疫苗的研發(fā)過(guò)程中，作為病毒載體的皰疹病毒往往缺失了主要毒力基因，對(duì)動(dòng)物體的致病力大大減弱，但其安全性還需進(jìn)行長(zhǎng)期且全面深入的分析。

皰疹病毒龐大的基因組中廣泛存在的復(fù)制非必需區(qū)為重組位點(diǎn)的優(yōu)化研究提供了基礎(chǔ)，選擇更優(yōu)的外源基因插入位點(diǎn)，更安全高效的表達(dá)元件，特別是高效啟動(dòng)子是重組活載體疫苗推廣應(yīng)用的基礎(chǔ)。重組皰疹病毒活載體疫苗優(yōu)勢(shì)得到充分的研究與利用后，將會(huì)在未來(lái)的動(dòng)物疫病防控中發(fā)揮重要作用。