組學技術在潰瘍性結腸炎中的應用進展*

王 磊，沈江立 綜述，李 娜△ 審校

1.呼倫貝爾市中蒙醫院肛腸科，內蒙古呼倫貝爾 021099；2.咸陽市中心醫院肛腸科，陜西咸陽 712000

潰瘍性結腸炎(UC)是一種慢性、非特異性、炎癥性腸道疾病[1]，通常病變從直腸開始，呈連續性、彌散性分布，可延伸累及至結腸近端的不同部位[2]。UC以復發交替的腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重等為典型臨床表現，還可伴有乏力、食欲減退、發熱等全身癥狀及關節病變(中軸型和外周型關節病變)、代謝性骨病、凝血功能異常等的腸外表現[1,3]。長期的炎癥可導致UC癌變及結腸炎相關結腸癌的出現[4]。近年來，UC的發病率和患病率呈上升趨勢，已被世界衛生組織(WHO)列入國際難治性疾病和終身性疾病名錄。歐美等發達國家UC的發病率為(8～14)/100 000，患病率則高達(120～200)/100 000；據報道，我國UC患病率約為11.6/100 000，北方地區發病率(1.64/100 000)與南方地區相比(2.05/100 000)略低[5]。UC發生與遺傳易感性、環境因素及心理因素等多因素密切相關，其發病機制與腸道免疫失衡、神經內分泌功能、腸黏膜屏障損傷等有關[6]。

隨著以高通量分析檢測為特征的組學技術的快速發展，涌現出代謝組學、基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、表觀基因組學、微生物組學、影像組學、宏基因組測序技術等現代生物學技術。這些新技術可在不同層面上反映生物體特征，揭示分子的復雜性，用于全面了解人類健康與疾病、生理與病理的內在關系，以及藥物作用相關分子機制[7]。本文將對組學技術在UC領域的應用現狀做一綜述。

1 代謝組學在UC疾病領域研究中的應用

1.1代謝組學在UC的研究現狀 自從NICHOLSON等[8]在1999年首次提出代謝組學概念以來，代謝組學主要通過核磁共振和質譜技術定性和定量分析目標生物體受內/外部生理刺激或遺傳基因修飾的內源性物質-代謝產物隨時間的多元動態變化參數，以期尋找與疾病或藥物相關的差異代謝產物[9-10]。臨床研究標本多為UC患者的血液、尿液或者糞便標本，具有標本輕松易得、取樣操作簡便等優點。耿曙光等[11]通過氣相色譜-質譜(GC-MS)檢測正常大鼠和UC大鼠結腸病變部位黏膜組織的代謝組學特征，結果得到9種差異性代謝產物，其中尿苷、腺嘌呤、胞嘧啶、甘氨酸、乳酸5種代謝物在UC模型組中明顯，牛磺酸、蘇氨酸、甘露糖、β-丙氨酸4種代謝物明顯低于對照組，可作為UC早期臨床診斷的生物標志物。DIAB等[12]采用氣相色譜-飛行時間質譜(GC-TOF-MS)和超高效液相色譜-質譜(UHPLC-MS)聯用技術進行代謝組學分析，檢測UC患者和健康志愿者，結果發現，從50條代謝通路中共鑒定出177個差異代謝產物，其中研究組差異明顯的代謝物是溶血磷脂酰膽堿、酰基肉堿和氨基酸，可導致腸道內環境穩態失衡。SUN等[13]對UC患者活動期(23例)、非活動期(25例)及對照組(30例)的糞便和血漿標本分別進行16S rRNA測序測序和液相色譜質譜(LC-MS)分析，結果發現活動期UC組血漿氧化三甲胺水平明顯高于非活動期，鞘脂代謝是富集顯著的通路之一，因此磷酸鞘氨醇可能成為治療UC的新靶點。

1.2代謝組學在UC治療中的研究發現 代謝組學在尋找新的早期疾病診斷、發病機制、藥效機制及預后生物標志物等方面作用顯著。徐霞等[14]通過超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜法檢測健康大鼠組、脾虛濕困型UC模型大鼠(中藥未干預)及脾虛濕困型UC模型大鼠給予參苓白術藥物干預的血漿標本，結果發現參苓白術散對脾虛濕困UC組大鼠的治療作用可能為抑制核因子-κB(NF-κB)信號通路表達，激活法尼醇X受體(FXR)受體、氧化應激和細胞色素P450表達，從而下調促炎因子的表達，改善緩解腸道病變炎癥狀態。馬光朝等[15]采用高效液相色譜-質譜技術檢測正常小鼠組、DSS模型組、雷公藤甲素治療組血清標本，結果發現，UC模型組小鼠和正常組小鼠血清代謝譜發生明顯改變，鑒定出膽酸、牛磺膽酸、鵝去氧膽酸、瓜氨酸、順式烏頭酸、γ-胍丁酸、乙酰膽堿、3,6-脫水半乳糖等15個差異代謝物，其機制可能與調節初級膽汁酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等代謝通路有關。

2 轉錄組學在UC研究中的進展狀況

2.1轉錄組學對UC的研究 轉錄組廣義上指在某一生理條件下，細胞內所有轉錄組產物的集合，包括mRNA、ncRNA、rRNA等；狹義上指所有mRNA的集合[16]。主要用于基因測序、表達譜分析、治療藥物篩選、疾病診斷和預測有效基因篩選等方面。通過分析表達基因，進一步揭示機體生理、病理狀態及疾病的發生、發展之間的內在聯系[17]。TAMAN等[18]利用測序技術對UC患者和健康對照者進行轉錄組測序，結果得到1 480個差異基因，其中MUC5B、REG3A、DEFA5和IL33可能是男性UC患者并發結直腸癌(CRC)的危險因素，AQP9在UC調控組織特異性生理作用，也揭示了UC發病機制中新的潛在因素。王家豐等[19]利用二代測序技術對UC患者進行轉錄組測序，結果發現攜帶HMGB1基因chr13-31127905位點突變型等位基因的個體患UC的風險明顯高于未攜帶者(P=0.017,OR=0.357,95%CI:0.157～0.812)，有望成為臨床中早期UC診斷篩查生物標志物。

2.2轉錄組學在UC治療中的應用 轉錄組學可快速、全面獲得生物個體特定條件下全部表達譜基因轉錄信息，符合中醫研究所注重的整體觀，全面、客觀、科學、系統地闡述中藥單體及復方多靶點、多通路復雜作用的機制。馬克龍等[20]通過高通量轉錄組測序技術研究白念珠菌定植的UC小鼠模型給予三黃湯干預后療效機制，結果顯示三黃湯組與模型組相比，篩選到383個差異表達基因顯著富集于NOD樣受體信號通路，表明作用機制可能與調控NOD樣受體信號通路密切相關。

3 蛋白質組學在UC研究中的應用

3.1蛋白質組學在UC領域的研究現狀 蛋白組學由澳大利亞的WILIKINS等[21]于1994年在意大利國際會議上首次提出，是指通過多種方式全方位多層次研究蛋白質在生物體內的表達水平，翻譯后修飾狀態，蛋白質相互作用方式和內在聯系；生理/病理狀態下表達差異，以及疾病特定狀態下生物標志物動態變化表達數量，從整體水平上探究特定生物體所有蛋白質組成、氨基酸序列和調控規律。蛋白質組學研究經典核心技術還是以雙向凝膠電泳、質譜MS技術和蛋白質生物信息學技術為主。HORIE等[22]通過雙向凝膠電泳、質譜技術對活動期和非活動期UC患者活檢標本進行蛋白質組學分析篩選，發現與非活動期UC患者相比，活動期UC患者過氧化物還原酶1(PRDX1)表達增加，同時UC患者黏膜隱窩上皮細胞中PRDX1和硫氧還蛋白(Trx)的表達與炎癥分級呈正相關。BENNIKE等[23]將UC患者和對照組經內鏡取結腸黏膜非炎癥活檢組織，采用高通量無凝膠定量蛋白質組學技術進行分析，結果發現活檢組織中鈣衛蛋白和乳糖轉鐵蛋白與活檢組織炎癥程度相關。

3.2蛋白質組學在UC治療中的應用 通過分析藥物治療前后蛋白表達水平的差異，有助于從整體角度全面分析中藥多靶點、多通路、多成分的藥效機制，符合中醫整體觀念的基本思想[24]。王婷婷等[25]在空白組、UC模型組、四逆湯治療UC大鼠組中分別采用蛋白質組學技術對遠端結腸組織篩選差異表達蛋白進行檢測，結果顯示四逆湯組篩選出78個與UC相關的差異蛋白，其核心蛋白共篩選出C反應蛋白、Ⅻ型膠原蛋白α1(COL12A1)等16個關鍵蛋白，通過驗證確定C反應蛋白及COL12A1為四逆湯干預UC的潛在關鍵靶點。

4 基因組學在UC研究中的應用

基因組學以生物體內所有基因為研究對象，闡述全基因組的結構、組成、存在方式、表達調控模式，基因定位與功能分析，基因間相互作用，以及全基因組在生物體生理、病理過程中的內在作用規律與外部影響機制。常用研究方法有脈沖場凝膠電泳、毛細管電泳、基因芯片技術、全基因組測序等。趙芯梅[26]對UC患者(同一部位反復活動期、靜止期共29例)通過基因組學技術，比較同一患者、同一部位、不同時期(活動期、靜止期和復發活動期)mRNA表達差異，結果得到UC活動期、靜止期差異表達基因1 732個，其中上調基因主要與炎癥反應、CRC癌基因和上皮間質轉化(EMT)有關；下調基因主要與CRC抑癌基因和過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)有關；同時發現，UC活動期及靜止期中細胞周期、凋亡相關基因顯著上調，細胞連接相關基因明顯下調。

5 表觀遺傳學在UC研究中的應用

表觀遺傳學是指基因的核苷酸序列未改變，基因功能表達了可遺傳信息的變化，從而使表型發生改變。表觀遺傳學正是通過DNA甲基化、組蛋白修飾、ncRNA調控等多種調控基因表達介導UC易感基因與環境因素的相互作用，與UC的發病機制及疾病的發生、發展關系密切[27]。李春曉[28]通過對UC患者與健康人群結直腸上皮組織標本進行IHC實驗發現，與對照組相比UC患者結腸上皮中的組蛋白H3乙酰化水平明顯下降，而且與疾病嚴重程度(蒙特利爾分級)呈明顯負相關；通過構建體外細胞(HCT116、Caco-2細胞)、TNBS誘導小鼠腸炎模型均發現組蛋白H3乙酰化水平在體外細胞系及體內動物模型中，較健康小鼠均顯著減少，表明結直腸炎癥組蛋白H3乙酰化水平受到抑制有關。

6 腸道菌群檢測的組學技術在UC研究中的應用

腸道菌群是宿主胃腸道內寄居并與之共生的數以萬計微生物群體(細菌、真菌、病毒)的總稱，定植在人體(宿主)腸道內的菌群數量達1013～1014個，種類多達500多種，組成復雜多樣的微生態系統，因此也被稱為人類第二基因組。腸道菌群大致分為三類：益生菌(如雙歧桿菌、乳酸菌等)、條件致病菌(如大腸埃希菌、腸球菌、腸桿菌等)和有害菌(如沙門氏菌等)。腸道內各種菌群相互依存、相互制約，通過多種生理功能(屏障功能、免疫功能、代謝與營養功能)維持腸道微生態穩定，保證腸道生理功能正常運行。如果腸道菌群處于紊亂狀態時(菌群數量和比例失調、致病菌增多)，生理功能動態失衡，破壞腸道黏膜屏障，免疫功能紊亂，菌群代謝產物異常，誘發了UC患者的腸道局部炎癥反應[29]。楊龍等[30]通過采集口服美沙拉嗪對照組、口服參苓白術散治療組和健康組志愿者的糞便進行DNA測序及生物信息學分析，結果發現相比于對照組及健康組，參苓白術散治療組中參苓、白術較能夠促進益生菌(雙歧桿菌、乳桿菌)生長，抑制致病菌增殖(腸桿菌、腸球菌、梭菌、擬桿菌)，上調腸道微生物雙歧桿菌與腸桿菌的數量比例，從而起到抗炎、維持內環境穩態，促進腸黏膜潰瘍愈合的作用。梁艷妮等[31]將UC小鼠分為對照組、模型組、柳氮磺胺吡啶干預組、靛玉紅干預組(低、中、高劑量)，通過16S rRNA高通量測序檢測UC小鼠腸道內容物，高通量測序結果發現靛玉紅治療UC，可能與恢復UC小鼠腸道菌群中擬桿菌門與厚壁菌門的比例密切相關。

7 多組學聯合在UC研究中的應用

UC發病機制十分復雜，單一組學檢測技術(基因組學、轉錄組學、代謝組學、蛋白質組學、表觀遺傳組學等)無法全面系統地揭示UC疾病發展過程，而從不同層次描述細胞內的生命活動各個環節的多組學技術的聯合運用，有助于從多方面、多角度闡述UC發病機制，將為研究UC發生、發展更為高效的方法[32]。MILLS等[33]通過對UC患者糞便標本進行16S rRNA、宏基因組、代謝組學、宏蛋白質組學測序，確定擬桿菌蛋白酶是提示疾病嚴重程度的標志物之一。馬琪[34]將白頭翁湯干預濕熱型UC大鼠，利用代謝組學技術(UPLC-Q/TOF-MS/MS)檢測UC大鼠不同造模階段與空白對照組的尿液標本差異代謝物，篩選白頭翁湯治療濕熱型UC的差異代謝物及靶標代謝通路，通過網絡藥理學篩選并構建“活性成分-靶點-疾病”及蛋白質相互作用網絡進行GO及KEGG通路富集分析，發現濕熱型UC的發病機制可能與5-羥基-N-甲酰基犬尿氨酸、γ-L-谷氨酰胺-L-半胱氨酸、左旋甲酰犬尿氨酸、亞油酸、核黃素-5-磷酸和左旋色氨酸等7種潛在差異代謝物水平變化有關；白頭翁湯治療濕熱型UC的機制可能與7-酮基去氧膽酸、五羥色胺和創傷酸水平變化有關。

綜上所述，UC病因與發病機制錯綜復雜、多不明確，仍是眾多學者研究熱點，代謝組學、基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、表觀遺傳組學和腸道菌群檢測等組學技術的迅速發展，多組學整合分析技術，有望在UC發病機制的研究、疾病的診斷及治療、新藥物的研發、診斷標志物的發現等方面提供新的切入點及方向，為UC患者特異性、個性化診療提供新思路。