結直腸癌患者腸道菌群與腸道免疫微環境關系的研究進展

朱琨 盧清軍 任翔 蔣宏

濱州醫學院附屬醫院結直腸疝外科，濱州 256000

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）目前居全球腫瘤疾病發病譜第3位和死因譜第2位。據國際癌癥研究機構發布的2020年全球最新癌癥數據顯示，全世界有超過193萬人新確診為CRC，其中，中國有超過55萬人為初診CRC患者，占中國新確診腫瘤人數的12.2%。數據表明，中國已成為全球CRC每年新發病例數和死亡病例數最多的國家，CRC嚴重影響和威脅我國居民身體健康［1］。目前，結腸癌的干預策略，如糞便微生物群移植、益生元、益生菌以及抗生素干預等，均顯示出作為腸道菌群調節劑的潛在治療價值。然而，腸道菌群的最終治療作用與其功能狀態及機體的免疫微環境關系密切。因此，探究腸道微生物群相關的系統生物學功能和潛在的分子機制對于發現新的、可操作的靶點以用于未來CRC患者的干預和臨床評估有至關重要的價值。

CRC腫瘤與腸道菌群

腸道菌群龐大且復雜，多達100萬億個微生物居住在腸道中，其密度接近每毫升1011～1012個細胞。腸道菌群作用于腸道微環境中的其他代謝物，在維持機體內環境穩態中發揮著重要的作用。機制十分復雜，目前的研究尚不明確。

腸道菌群與腫瘤的關系密不可分，不僅可直接促進腸道腫瘤的發生，腸道菌群及其代謝物還可影響遠離腸道部位的癌癥發展。例如，菌群從腸腔易位到胰腺促進胰腺腫瘤的發生；肝臟中沒有腸道菌群，然而，腸道菌群通過炎癥微生物相關的分子模式和細菌代謝物促進肝細胞癌的發生［2］；腸道菌群還是胰島素抵抗的關鍵因素，是多囊卵巢綜合征發生的重要原因之一［3］。

CRC中宿主與菌群的相互作用關系被初步證明于1975年，當時觀察到致病性二甲基肼在無菌大鼠中誘發的結腸腫瘤明顯少于腸道菌群正常的大鼠。此外，相對于接受健康菌群的小鼠而言，接受CRC糞便菌群的小鼠腸息肉數量更多。由于包括16S rRNA和鳥槍法宏基因組學在內的微生物組分析技術的發展，與健康對照個體相比，CRC患者的腸道菌群成分有差異是顯而易見的，被概括為“菌群失調”。在CRC腫瘤組織中檢測出較高含量的核梭菌、大腸埃希氏菌、脆弱擬桿菌、糞腸球菌、解脲鏈球菌和消化鏈球菌菌種，而所謂的保護性菌屬包括羅氏菌、梭菌、費卡桿菌和雙歧桿菌在內的細菌數量明顯減少［4-5］。這些差異中的一些（梭菌水平最一致）與臨床結局和化療敏感性相關，因此這類細菌具有作為生物標志物的潛力。然而，這種菌群類型和數量的變化究竟是癌癥的原因還是結果，是否能將CRC的發生歸因于某些特定的“致癌”微生物，仍具有挑戰性。

腸道免疫微環境

腸道是人體最大的消化器官，除了通過消化食物以促進營養物質的吸收外，腸道還具有多種其他功能，包括傳遞信息和調節新陳代謝［6］。腸道的獨特結構使其長期暴露于各種抗原和微生物之中，為了保護機體免受病原體的侵害以及維持內環境穩定，人體腸道已經進化出成熟的腸道免疫系統［7］。這個錯綜復雜的系統由腸上皮細胞（intestinal epithelial cells，IECs）、固有層細胞及腸淋巴組織細胞構成。其中IECs是腸道免疫系統的單層物理屏障，而屏障的完整性由上皮間緊密連接蛋白和保護性黏蛋白的分泌進一步加強。除了作為物理屏障的功能外，IECs還通過模式識別受體感知腸道菌群。刺激這些受體可促進上皮細胞修復和緊密連接蛋白的上調，并觸發向固有層細胞發出信號的各種細胞因子的產生。更重要的是，IECs不是孤立的，而是作為免疫細胞和間充質的三聯體。如果上皮屏障防御被微生物或其產物破壞，免疫細胞和間充質細胞通過啟動維持上皮完整性的信號網絡級聯，充當第二道防線［8］。例如，核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強（nuclear factor kappa-B，NF-κb）和信號轉導和轉錄激活3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路的激活可以觸發生長因子和細胞因子的產生，從而支持穩態組織修復［8］。

腸道免疫系統的激活取決于病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的表達，例如腸道微生物產物。腸道菌群分泌的多種代謝物、細菌素以及其他PAMPs通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）和其對上皮細胞的粘附激活腸道免疫系統，進而影響CRC的發生和發展。腸道中的IECs及免疫細胞表達一系列PRRs，如Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）和NOD樣受體（NOD-like receptors，NLRs）。這些受體能夠直接感測碳水化合物和脂質基細菌細胞壁成分，例如脂多糖、肽聚糖、脂質酸和其他PAMPs，從而激活免疫系統［9］。某些細菌分泌的脂蛋白和脂多糖能夠被髓系細胞、黏膜上皮細胞和其他免疫細胞表面的TLR-1、TLR-2、TLR-4、TLR-6、TLR-10識別［10］。分節絲狀細菌、沙門氏菌和病態變形桿菌等通過TLRs激活吞噬細胞，并進一步誘導適應性免疫細胞中Th17和Th1反應的激活，分泌促炎細胞因 子 ，如 白 細 胞 介 素（interleukins，ILs）IL-1β、IL-6和IL-23［11］。

正常人群中腸道菌群對腸道免疫系統的影響

1、促進腸道免疫系統的發育

有研究表明，在嬰兒時期，腸道內定植的微生物群落可刺激腸黏膜相關淋巴組織的成熟［12］。如果在這個時期未能形成適當的腸道菌群，腸道免疫系統將會受到影響進而導致CRC的發病率增加。

2、調控腸道中T、B淋巴細胞分化

腸道中的T淋巴細胞以及B淋巴細胞位于IECs下層的固有層。在健康個體中，腸道菌群能通過調節T淋巴細胞以及B淋巴細胞等刺激先天性免疫和獲得性免疫或阻止不適當的先天性免疫和獲得性免疫來維持腸道穩態。梭狀芽孢桿菌等革蘭陽性菌能夠促進小鼠免疫反應，尤其能誘導調節T細胞及輔助性T細胞Th17細胞的增殖分化，并促進腸道Th17細胞產生IL-17［13］。腸道菌群在誘導B淋巴細胞合成與釋放分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）的過程中起關鍵作用，而SIgA是腸道菌群影響宿主的主要關鍵因子［14］。

3、促進細胞因子產生

細胞因子是由免疫細胞產生的，具有調節免疫、炎癥及造血功能的小分子蛋白質，包括ILs、腫瘤壞死因子、干擾素、轉化生長因子和趨化因子等。Satoh-Takayama等［15］研究發現腸道菌群誘導自然殺傷細胞產生IL-22，促進機體產生黏膜免疫。

4、促進腸道黏膜內基因的表達

腸道微生物能夠上調小鼠各腸段內多種基因的表達，包括與免疫相關的基因如CCL5和CXCL9等，以及腸道屏障功能相關的基因如小脯氨酸豐富蛋白1A（SPRR1A）和高分子黏蛋白2（MUC2）等［16］。

CRC患者腸道菌群對腸道免疫微環境的影響

腸道菌群通過改變腸道免疫系統的結構和功能重塑免疫微環境影響CRC的發生。研究報道，腸道菌群可以分泌多種代謝物和細菌素，同時，其也通過表達特定的抗原、對上皮細胞的粘附以及與PRRs的相互作用來激活腸道免疫系統。腸道免疫系統的穩定會保護腸道黏膜，但當穩定被打破，也可能導致一系列促炎細胞因子過量釋放加重腸道炎癥，繼而癌變。

Wu等［17］學者通過小鼠實驗發現產腸毒素的脆弱芽孢桿 菌 （Enterotoxigenic Bacteroides fragilis，ETBF） 在ApcMin/+mice80中誘導由STAT3激活驅動的促致癌Th17反應。伴隨著單核細胞樣髓系來源抑制細胞（monocytic-like myeloid-derived suppressor cells，M-MDSCs）的募集和分化，腫瘤內IL-17A結合IL-17R+髓系細胞驅動Nos2上調。這些M-MDSCs抑制細胞毒性CD8+T細胞的活性，同時誘導腫瘤生長和血管生成相關基因的表達［18］。值得注意的是，ETBF可能會引起遠端結腸MDSCs積聚，上皮細胞中的NF-κb信號觸發髓細胞募集趨化因子CXCL1和CXCL2的表達［19］。該研究是少數幾個考慮腫瘤位置的研究之一，腫瘤位置是一個重要的變量，為整個結腸中不同的微生物和免疫生態位以及臨床前CRC模型中微生物群的位置特異性效應提供了證據。在人體中，ETBF同樣以NF-κb依賴的方式誘導上皮細胞表達和分泌CXCL1直系同源物IL-8［20］。

在硫酸葡聚糖鈉鹽誘導的CRC小鼠模型中，用溶血性鏈球菌灌胃會導致腫瘤負荷增加、誘導免疫抑制性CD11b+髓系群體以及髓系來源的細胞因子（包括IL-6和IL-8）水平增加［21］。在喂食有核粒細胞的ApcMin/+小鼠中，腫瘤負荷增加的同時，腫瘤內免疫抑制性髓樣細胞的數量也增加，主要包括單核和粒細胞骨髓間充質干細胞、腫瘤相關巨噬細胞、腫瘤相關中性粒細胞和樹突狀細胞。在離體共培養實驗中，分離小鼠腫瘤的骨髓間充質干細胞和腫瘤相關巨噬細胞能夠抑制CD4+T細胞的增殖［22］。有研究發現，厭氧消化鏈球菌通過選擇性粘附結腸癌細胞并誘導NF-κb，也可引發ApcMin/+小鼠中腫瘤前髓細胞群的擴增，同時，調節性T細胞、Th17和細胞毒性CD8+T細胞也會隨之增加［23］。國外學者研究發現具核梭桿菌還可以以細胞因子的方式直接抑制自然殺傷細胞毒性，使腫瘤能夠逃避免疫破壞［24］。

腫瘤細胞通過募集某些免疫細胞營造適宜腫瘤生長的微環境，而腸道菌群可以通過影響這些免疫細胞的密度和組成進而影響腫瘤細胞生長。例如，擬桿菌門和厚壁菌門可以通過淋巴細胞吸引趨化因子CCL5、CCL20和CXCL11，同時具核細菌和大腸桿菌可以通過體外途徑誘導趨化因子產生［25］。但腸道菌群誘導的免疫細胞對腫瘤細胞起抑制還是保護作用，目前的研究尚不一致。有研究證實，在IECs缺乏自噬調節基因Atg7的小鼠中，微生物菌群與細胞毒性CD8+T細胞和CD4+Th1反應存在相關性，但也有研究證實，CD8+T細胞并不總是抑制腫瘤生長的。一種以普雷沃氏菌科的豐度增加為特征的小鼠微生物群誘導CD8+T細胞產生，但其表現為較高的腫瘤負荷。盡管相互關聯，這項研究強調了表征細胞的激活狀態及其豐度的重要性，因為功能失調的T細胞可能有助于腫瘤的逃避［26］。

CRC還與細菌失調導致促炎性細胞因子的產生息息相關，包括IL-1β、IL-23、IL-22、IL-27，特別重要的是IL-17A和IL-6［27-29］。在小鼠和人類中，發現IL-6、IL-23和IL-17A在被細菌浸潤的腫瘤中的表達增加［28-29］。IL-23和IL-6是Th17衍生細胞因子IL-17A和IL-22的有效誘導劑［30］；此外，IL-6與其在IECs上的受體結合，引發異常增殖［31-33］。國外學者進一步研究了受體表達模式的重要性，該研究表明CD4+T細胞特異性切除IL-1受體可減少CRC引發的炎癥，而髓系細胞上的這種受體缺乏則提高了腸道細菌的侵襲能力和IL-17A的分泌活性，進而促進CRC的進展［34］。

腸道菌群可以通過TLR/Myd88依賴性信號通路促進IECs對IL-17C的上調來促進CRC的發展。IL-17C以自分泌方式誘導凋亡抑制因子Bcl-2和Bcl-xl在IECs中的表達，以促進細胞存活和腫瘤發生。例如，具核梭桿菌能夠通過TLR4和TLR2影響CRC。TLR2/4的刺激導致miR-18a和miR-4802表達選擇性缺失，導致自噬相關蛋白ULK1和ATG7表達降低以及miR-34a表達上調，從而使CRC細胞對化療的耐藥性增加以及促進CRC的進展［35］。

小 結

綜上所述，腸道菌群可以調節宿主腸道免疫微環境，并有助于維持腸道免疫微環境的穩態和抑制過度炎癥。然而，當腸道菌群紊亂，一些致病菌屬增多時，可以通過改變免疫細胞的密度和組成、刺激促炎細胞因子過量釋放等機制影響腸道免疫微環境，進而促進CRC的產生與發展。因此，某些特殊的腸道微生物、相關代謝產物以及特異性免疫細胞的差異表達在CRC的早期診斷方面具有潛在的應用價值，值得進一步的臨床與基礎研究。