基于網絡藥理學及分子對接探討烏丹降脂膠囊治療非酒精性脂肪肝的作用機制※

李圣豪 戴慕巍 王 芳 馮彩霞 賈彥生 王 超 郝立園 李耀琪 閆會敏

(1.河北省石家莊市第五醫院藥劑科，河北 石家莊 050021；2.河北醫科大學第四醫院骨科，河北 石家莊 050011；3.河北醫科大學流行病學教研室2020級碩士研究生，河北 石家莊 050017；4.河北省石家莊市第五醫院消化內鏡室，河北 石家莊 050021；5.河北中醫學院2019級碩士研究生，河北 石家莊 050200；6.河北醫科大學流行病學教研室2021級碩士研究生，河北 石家莊 050017；7.河北省石家莊市第五醫院臨床醫學研究所，河北 石家莊 050021)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精及其他的肝損傷因素導致肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的綜合征，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的獲得性代謝應激性肝損傷[1]，與肥胖、2型糖尿病和心血管疾病關系密切[2]。NAFLD在全球的患病率約為25%，是肝硬化和肝細胞癌的主要原因[3]。西醫方面主要采用保肝藥、抗氧化劑、脂代謝調節劑等藥物治療，尚無特效藥物[4]，由于其不良反應多，單一藥物無法滿足，治療效果欠佳。

NAFLD在中醫上歸屬于“積證”“痰證”范疇，其疾病性質本虛標實，本虛為陽氣不足，標實為痰濕、瘀血、氣滯等[5]。烏丹降脂膠囊為河北省石家莊市第五醫院自制的中藥制劑，由山楂、決明子、陳皮、法半夏、茯苓、澤瀉、丹參、大黃、茵陳、黃芪、北柴胡、何首烏、炙甘草13 味中藥組成(國家專利號：CN201310063372.4)，具有健脾化痰、活血化瘀功效[6]。本研究擬應用網絡藥理學和分子對接方法，借助藥物和疾病等多個數據庫，構建烏丹降脂膠囊成分與靶點網絡，并采用分子對接技術驗證烏丹降脂膠囊與核心靶點的關系，較為整體地預測烏丹降脂膠囊治療NAFLD的機制。

1 資料與方法

1.1 烏丹降脂膠囊活性成分篩選及靶點獲取 中醫藥百科全書(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/)數據庫[7]采用多種權威算法計算藥物動力學參數、藥物相似度及預測作用靶點。本研究利用ETCM數據庫獲取烏丹降脂膠囊13味中藥的活性成分和作用靶點。

1.2 NAFLD靶點的獲取 以“nonalcoholic fatty liver disease”和“NAFLD”為疾病檢索詞，分別在The Human Gene Database(GeneCards，https://www.genecards.org/)[8]、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM，https://omim.org/)和Therapeutic Target Database數據庫(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)[9]進行搜索，收集疾病相關靶點。根據GeneCards數據庫score值≥中位數的靶點設定是NAFLD的潛在靶點。合并以上3個疾病數據庫，并且刪除重復條目，得到NAFLD的靶點。

1.3 “藥物-疾病”交集靶點獲取 將獲取的烏丹降脂膠囊靶點與NAFLD靶點通過Venn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)[9]取交集并繪制Venn圖。

1.4 “藥物-成分-靶點”網絡圖的構建和分析 將以上步驟得到的藥物有效活性成分、交集靶點進行數據整合。運用 Cytoscape 3.8.2[10]軟件繪制“藥物-成分-靶點”網絡圖。利用Cytoscape 3.8.2軟件中“Network Analyzer”的功能，計算出不同節點的度(Degree)值，根據Degree值的大小排序，篩選前3位作為烏丹降脂膠囊的核心活性成分。

1.5 蛋白質與蛋白質相互作用(PPI)網絡構建及分析 將藥物與疾病的交集靶點提交到STRING 11.5數據庫(https://cn.string-db.org/)[11]，限定物種為 “Homo sapiens”，且“medium confidence = 0. 4”，去除游離的靶點，構建PPI網絡圖。此外，使用Cytoscape 3.8.2中的MCODE插件分析PPI網絡，確定關鍵功能模塊；同時還應用Cytoscape 3.8.2的插件CytoHubba計算出Degree值較高的前10個核心靶點。

1.6 交集靶點的基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 將藥物與疾病交集靶點輸入到Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery database(DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)數據庫[12]，進行GO和KEGG分析。物種限定為“Homo Sapiens”，以P<0.05且靶點數(count值)≥10為篩選條件，并應用bioinformatics(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行可視化。GO分為三大類，分別是生物學過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。

1.7 分子對接的驗證 為了更加進一步評價藥物活性成分與靶點的結合能力，進行了分子對接的驗證。應用PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[13]下載活性成分的2D結構，導入Chem3D軟件調整其空間構象，進行能量最優化。Uniprot數據(https://www.uniprot.org/)[13]中尋找核心靶點對應蛋白，然后通過PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載靶蛋白結構。在PyMol軟件中除去水分子和小分子配體，使用AutoDock Tools 1.5.6軟件添加氫鍵，最后對受體和配體進行分子對接，從而得到分子對接的數值。

2 結果

2.1 烏丹降脂膠囊相關活性成分和作用靶點的獲得 通過ETCM數據庫，獲得烏丹降脂膠囊中山楂活性成分為28個，決明子活性成分為24個，陳皮活性成分為12個，半夏活性成分為21個，茯苓活性成分為32個，澤瀉活性成分為21個，丹參活性成分為35個，大黃活性成分為79個，茵陳活性成分為40個，黃芪活性成分為24個，何首烏活性成分為18個，柴胡活性成分為41個，甘草活性成分為64個。將這13味中藥活性成分合并后刪除重復值，獲得393種活性成分和812個作用靶點。應用Cytoscape 3.8.2中“Network Analyzer”對烏丹降脂膠囊活性成分和作用靶點分析，基于它們之間的Degree值、鄰域連通性(Neighborhood connectivity)和緊密中心性(Closeness centrality)，按照Degree值≥70篩選出21個烏丹降脂膠囊的主要活性成分，見表1。

表1 烏丹降脂膠囊主要活性成分(前21個)

2.2 NAFLD相關靶點獲得 應用GeneCards 數據庫獲得1091個NAFLD相關靶點，根據score值≥中位數視為NAFLD潛在靶點，在GeneCards數據庫，NAFLD相關靶點中score最大值是19.15，最小值是0.12，中位數是0.35。然后將GeneCards、TTD和OMIM數據庫靶點合并刪除重復值，最終獲得1142個NAFLD相關的靶點。

2.3 “藥物-疾病”交集靶點篩選 將預測的烏丹降脂膠囊藥物的靶點(812個)與NAFLD疾病的靶點(1142個)取交集，得到烏丹降脂膠囊與NAFLD交集靶點107個，并繪制Venn圖，見圖1。

圖1 烏丹降脂膠囊和NAFLD靶點的Venn圖

2.4 “藥物-成分-靶點”的網絡構建和分析 通過對“藥物-疾病”交集靶點進行反向推導，得到烏丹降脂膠囊作用于NAFLD的活性成分有382個。使用 Cytoscape 3.8.2軟件將382個活性成分和107個“藥物-疾病”交集靶點進行關聯，并構建“藥物-成分-靶點”網絡圖，見圖2(紅色為藥物，藍色為成分，紫色為靶點)。圖中包括462個節點和1958條邊，一個節點Degree值越大則表示該成分發揮作用的可能性越大，或者是該靶點與疾病的相關性越大。進一步應用 Cytoscape 3.8.2中“Network Analyzer”功能篩選，篩選出烏丹降脂膠囊治療NAFLD的核心活性成分，分別是阿里紅酸(Officinalic acid)、棕櫚酸(Cetylic acid)和辛酸(Caprylic acid)。

圖2 藥物-成分-靶點網絡圖

2.5 PPI網絡構建及分析 將107個靶點導入STRING11.5數據庫中，獲得PPI網絡，并導入 Cytoscape 3.8.2軟件進行可視化，見圖3A(由綠色到藍色，Degree值越來越大。顏色越深，Degree值越大)。最終該PPI網絡圖共包括102個節點，773條邊。靶點以節點表示，靶點間相互作用關系以每個節點之間的線條表示，靶點相互作用強度以Degree值表示，其值越大，作用越強。節點的顏色與節點的Degree值成正比，即Degree值越大，節點顏色越深。由于 PPI 網絡中蛋白的作用是相互的，為了能更加精確地分析烏丹降脂膠囊治療NAFLD的作用機制，在得到烏丹降脂膠囊和NAFLD交集靶點的PPI網絡后，進行聚類構建功能模塊構建。因此，運用Cytoscape 3.8.2軟件中MCODE插件，得到 5個關鍵模塊，每個模塊中的蛋白有著更為緊密的聯系，共同執行著某個生物過程，見圖3B。此外，運用插件CytoHubba計算出得分較高的前10個核心靶點，包括過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARA)、胰島素(insulin，INS)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG)、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、細胞色素P450家族2亞科E成員1(cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1，CYP2E1)、肌動蛋白β(actin beta，ACTB)、白蛋白(albumin，ALB)和熱休克蛋白90α家族A級成員1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1)，見圖3C(由黃色變紅色，Degree值由小變大)。

注：A 藥物-疾病交集靶點PPI網絡圖；B MCODE分析PPI網絡圖；C 前10個核心靶點

2.6 交集靶點的GO富集分析和KEGG富集分析 將藥物與疾病的107個交集靶點基因導入DAVID數據庫，進行GO功能注釋。根據P值和count值進行篩選，選擇有統計學意義的 BP、CC、MF條目繪制柱形圖，顏色越紅，P值越小，柱形越長，count值越大。結果顯示BP包括16個條目，CC包括17個條目，MF包括10個條目。其中BP主要集中在外來物質的代謝過程(Xenobiotic metabolic process)、細胞對脂多糖的反應(Cellular response to lipopolysaccharide)、對外來刺激的反應(Response to xenobiotic stimulus)、脂質代謝過程(Lipid metabolic process)、翻譯起始(Translational initiation)、藥物反應(Response to drug)、細胞因子介導的信號通路(Cytokine mediated signaling pathway)、基因表達的正向調節(Positive regulation of gene expression)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、炎性反應(Inflammatory response)、負調控凋亡過程(Negative regulation of apoptotic process)、DNA模板的轉錄正調控(Positive regulation of transcription, DNA-templated)、嗜中性粒細胞脫顆粒(Neutrophil degranulation)、DNA模板的轉錄負調控(Negative regulation of transcription, DNA-templated)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄負調控(Negative regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)和細胞分化(Cell differentiation)等，見圖4A；CC主要集中在細胞外泌體(Extracellular exosome)、粘著斑(Focal adhesion)、膜(Membrane)、胞質(Cytosol)、內質網(Endoplasmic reticulum)、內質網腔(Endoplasmic reticulum lumen)、細胞質(Cytoplasm)、大分子復合物(Macromolecular complex)、胞外區(Extracellular region)、內質網膜(Endoplasmic reticulum membrane)、細胞外間隙(Extracellular space)、核(Nucleus)、核漿(Nucleoplasm)、細胞表面(Cell surface)、胞質核周區(Perinuclear region of cytoplasm)、染色質(Chromatin)和細胞內細胞器(Intracellular membrane-bounded organelle)等，見圖4B；MF主要集中在RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity, ligand-activated sequence-specific DNA binding)、相同蛋白的結合(Identical protein binding)、RNA結合(RNA binding)、氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)、蛋白質同源二聚化活性(Protein homodimerization activity)、酶結合(Enzyme binding)、蛋白結合(Protein binding)、鋅離子結合(Zinc ion binding)、轉錄因子活性、序列特異性DNA結合(Transcription factor activity, sequence-specific DNA binding)和ATP結合(ATP binding)等，見圖4C。

注：A為BP分析；B為CC分析；C為MF分析

應用DAVID數據庫進行KEGG通路富集分析，根據P值和count值篩選有明顯統計學差異的通路，共有7條。7條通路分別是細胞色素P450對外來生物的代謝(Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)、酒精性肝病(Alcoholic liver disease)、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)、冠狀病毒病-COVID-19(Coronavirus disease - COVID-19)、胰島素抵抗(Insulin resistance)、脂質和動脈粥樣硬化(Lipid and atherosclerosis)和代謝途徑(Metabolic pathways)，見圖5。結果表明這些通路可能是研究烏丹降脂膠囊治療NAFLD主要通路。

圖5 KEGG富集分析圖

2.7 分子對接驗證 為了進一步驗證烏丹降脂膠囊對NAFLD的治療作用，借助 AutoDock Vina 軟件進行分子對接，將Degree值最高的核心活性成分阿里紅酸、棕櫚酸和辛酸分別與10個核心蛋白進行分子對接。研究表明靶點蛋白與活性成分的最低結合能小于-5 kcal/mol認為二者結合穩定[14]，且結合能數值越低，構象越穩定 (見表3)，其中阿里紅酸與PPARA、CYP2E1、TNF、ACTB和ALB的結合性最好，PyMol軟件進行可視化，見圖6。由圖可知，阿里紅酸與PPARA在VAL-407、HIS-411處形成氫鍵； 阿里紅酸與PPARG在GLN-451處形成氫鍵；阿里紅酸與TNF在GLN-355處形成氫鍵；阿里紅酸與ACTB在ARG-254、ARG-75、PHE-106處形成氫鍵；阿里紅酸與ALB在LYS-190處形成氫鍵。

表2 核心活性成分與核心靶點的分子對接結果 kcal/mol

圖6 核心活性成分阿里紅酸與核心靶點的分子對接圖

3 討論

中醫古籍中并無NAFLD記載，NAFLD在中醫上歸屬于“脅痛”“肝著”“痰濁”“癥瘕”“積聚”“痰痞”“肥氣”等范疇[15]。NAFLD主要病因是過食肥甘厚味，主要病機為肝郁脾虛，痰濁內蘊[16]。烏丹降脂膠囊具有健脾化痰、活血化瘀功效，方中陳皮理氣燥濕，半夏燥濕化痰、散結消痞，茯苓健脾祛濕，使濕去脾旺，三藥合用祛濕化痰，調節脾胃；山楂健脾開胃、消食化積、活血化瘀，黃芪益氣健脾，澤瀉利水滲濕，柴胡疏肝解郁，丹參活血化瘀，決明子潤腸通便，茵陳清熱利濕、退黃，大黃逐瘀攻積。諸藥相合，既能益氣健脾，行氣散結，又能活血散瘀，利濕消積。

NAFLD的病理進展一般分為3個過程，即脂肪變性、脂肪毒性和炎癥。脂肪變性、氧化應激和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6等炎癥介質的存在與NAFLD中組成性活性/雄甾烷受體(constitutive active/androstane receptor，CAR)、孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)、PPARA等核因子的改變有關，這些因素可能導致藥物代謝酶或轉運體的表達和活性改變[17]。本研究中，網絡藥理學結果表明，烏丹降脂膠囊中有382個活性成分可用于NAFLD疾病的治療，其中涉及107個靶點。前10個核心靶點分別為PPARA、PPARG、IL-6、TNF、INS、CYP2E1、ACTB、ALB、HSP90AA1和TLR4。其中，脂肪變性導致核因子κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)激活，進而激活TNF-α和IL-6等炎癥因子，從而介導NASH中炎癥發生[18]。TLR是一類模式識別受體家族，通過病原體相關的分子模式識別激活固有免疫系統[19]。TLR1-5在NAFLD中升高，促進NAFLD的發展[20]，而且TLR4通過激活X-box結合蛋白-1(X-box binding protein-1，XBP1)從而誘導非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)[21]。PPAR包括α、β、γ在脂肪酸分解代謝作用和戊糖磷酸能量代謝中發揮重要作用[22]。PPARA調節脂肪酸轉運、線粒體β氧化和脂肪分解，其缺失導致非酒精性脂肪肝炎病變更加嚴重[23]。PPARG在脂肪組織中高度表達，在脂肪形成、脂肪細胞分化和脂質代謝的調節中發揮重要作用[24]。PPARG被激活后胰島素敏感性提高，還促進脂肪細胞分化，增加脂肪組織對游離脂肪酸的攝取，加速NAFLD發展[25]。CYP2家族是最重要的藥物代謝酶，CYP2E1是目前研究最多的與NAFLD相關的酶，研究顯示人和嚙齒類動物的NAFLD中，CYP2E1的表達和活性增強[26-27]。TNF-α是一種重要的促炎細胞因子，參與多種肝臟損傷。在嚙齒動物的NAFLD模型中，TNF-α拮抗劑減輕肝臟炎癥，甚至逆轉脂肪變性[28]。TNF-α抑制劑還能改善非酒精性脂肪性肝炎患者的組織學特征[29]。ALB是最豐富的蛋白質，具有抗氧化、抗炎等多種功能。研究表明NAFLD患者的ALB(包括對金屬和脂肪酸)的結合能力降低，因此，ALB結合功能可作為早期肝損傷的指標[30]。烏丹降脂膠囊能作用于這些靶基因，改善核因子釋放、減少胰島素抵抗、減少炎癥因子釋放、改善藥物代謝酶等方面達到治療NAFLD的目的。

GO分析的結果顯示，烏丹降脂膠囊治療NAFLD的靶點主要分布細胞質、細胞膜、內質網膜、細胞核、染色質等細胞組分；具有聚合酶Ⅱ轉錄因子活性、蛋白質同源二聚化活性、蛋白結合、鋅離子結合、酶結合、ATP結合等分子功能；主要參與炎性反應、藥物反應、細胞對脂多糖的反應、脂質代謝過程等生物學過程。由此可見烏丹降脂膠囊治療NAFLD是通過參與多種細胞組分、多種分子功能、多種生物學過程發揮作用的。

KEGG通路富集結果表明，烏丹降脂膠囊通過細胞色素P450對外來生物的代謝、酒精性肝病、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)信號通路、新型冠狀病毒肺炎、胰島素抵抗、脂質和動脈粥樣硬化以及代謝途徑等通路達到治療NAFLD的作用。已有研究表明胰島素抵抗是NAFLD進展的關鍵，NAFLD與胰島素抵抗密切相關，70%～80%的肥胖和糖尿病患者患有NAFLD[31-32]；而且炎癥因子、胰島素抵抗與NAFLD三者之間可能存在一定聯系，TNF-α和IL-1β等炎癥介質的分泌，導致胰島素抵抗和NASH[33]。研究還表明，胰島素抵抗可能誘導NAFLD中CYP2E1的高表達和高活性[34]，細胞色素P450(cytochromeP450，CYP450)是參與多種內源性和外源性化合物代謝的酶，主要在肝臟中表達[35]，CYP2E1介導活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生，促進NAFLD發展[36]。

此外，山楂是薔薇科山里紅或山楂的干燥成熟果實，氣微清香，味酸、微甜。入肝、脾、胃經，具有消食健胃、行氣散瘀功效，含有機酸類等活性成分，具有促進脂肪消化、降脂等作用，山楂對NAFLD有良好的治療效果，在緩解氧化應激[37]、促進脂質代謝[38]、抑制血小板聚集[39]等多個方面產生治療作用。前期研究發現，烏丹降脂膠囊能降低胰島素、TNF-α和NF-κB表達，減輕炎性反應，促進肝細胞功能恢復[40]。本研究發現，阿里紅酸與核心靶點具有較好的結合，表明烏丹降脂膠囊能通過多成分、多靶點治療NAFLD。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學技術，初步探索了烏丹降脂膠囊對NAFLD治療的多層次機制。該結果為進一步實驗研究及臨床應用提供一定依據，也為烏丹降脂膠囊治療 NAFLD的研究提供一定思路。但是，本研究存在一定局限性，不同劑量可能產生不同的效果，數據庫的不同也可能導致研究結果不一致，烏丹降脂膠囊含有的主要成分對于NAFLD的靶點是抑制作用還是促進作用尚不明確。因此，今后需進一步通過實驗進行驗證。