鹿紅方調控Nrf2因子保護缺血/再灌注損傷心肌細胞的機制研究

蔡 婉，葛 文，王 婧，周 華，池 浩

急性心肌梗死(acute myocardial infraction，AMI)是指冠狀動脈急性缺血、缺氧導致的心肌壞死，是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的一種危急重癥。經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)使急性心肌梗死的治療取得了巨大進步，早期冠狀動脈血運重建已使AMI的死亡率下降，但有研究表明，PCI術后1年內病死率高達7%～12%和心力衰竭發生率為22%[1]，早期血運重建后心律失常發生率較高[2]。心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的機制包括氧化應激損傷、炎癥反應、細胞毒性以及細胞凋亡等，其中氧化應激損傷作為一個重要因素，氧自由基的大量增加破壞線粒體膜結構，導致鈣超載和線粒體內膜電位的崩潰，從而導致心肌細胞損傷及死亡[3-4]。

研究表明，Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Keap-1)/核因子相關因子-2(Nrf2)/抗氧化結合原件(ARE)信號通路在抗氧化損傷中有重要作用[5]。Nrf2因子是機體內維持氧化還原反應的主要因子之一，當細胞內氧自由基增加時，Nrf2從Keap-1上撤離，移位至細胞核中，與ARE結合，啟動下游抗氧化蛋白、解毒酶等基因表達，從而發揮抗氧化的作用[6]。既往研究表明，Nrf2信號通路的激活可明顯改善心肌梗死后小鼠的心功能，Nrf2基因敲除后，小鼠快速發展為心力衰竭，死亡率也隨之增加[7-8]。Nrf2因子通過抗氧化應激反應從而達到保護心肌細胞的作用[7，9]。

中藥復方鹿紅方具有成分復雜及作用途徑、靶點多樣等特點，主要用于胸痹心痛、喘證等的治療，臨床研究表明，鹿紅方能夠有效改善心肌梗死后心力衰竭的臨床癥狀，調節冠狀動脈微循環[10]，鹿紅方預處理可以提高小鼠抗氧化應激水平[11]。本研究基于機體內抗氧化信號通路，采用大鼠結扎前降支復制心肌缺血再灌注損傷模型及H9c2心肌細胞缺氧/復氧模型，鹿紅方藥物干預，觀察小鼠心肌梗死面積、心肌細胞凋亡率、氧化因子以及Nrf2信號通路相關蛋白表達，在動物及細胞水平探討鹿紅方對心肌缺血再灌注損傷心肌細胞的保護作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級Wistar雄性大鼠40只，體質量(220±20)g，實驗動物購自北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司(動物生產許可證號：SCXK<滬>2017-00，11；使用動物許可證號：SCXK<滬>2020-0002)；清潔級健康成年雄性SD大鼠20只，體質量(220±20)g，購自上海中醫藥大學實驗動物中心(使用動物許可證號：SYXK<滬>2014-0008)。所有動物均飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心無菌級動物房，室溫(23±2)℃，濕度(55±5)%，普通飼料喂養，自由飲水。實驗過程中所有操作均符合實驗動物倫理委員會規定。

1.2 實驗細胞 H9c2心肌細胞購自Lonza公司。將保存于液氮中的H9c2細胞于37 ℃水浴中震蕩融化，吸出細胞懸液于37 ℃培養箱中培養傳代，細胞傳代4～5代后分裝于凍存管中凍存備用。

1.3 實驗試劑及設備

1.3.1 實驗試劑 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，購自美國Sigma公司，批號：BCBW5177)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所，批號：20180115)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所，批號：20171203)；心肌肌鈣蛋白I(cTnI)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所，批號：20170927)；谷胱甘肽(GSH)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所，批號：20180803)；丙二醛(MDA)(購自南京建成生物工程研究所，批號：20180406)；超氧化物歧化酶(SOD)(購自南京建成生物工程研究所，批號：20170916)；亞鐵離子(Fe2+)(購自南京建成生物工程研究所，批號：20180129)；RIPA裂解液(購自上海碧云天生物科技有限公司，批號：P0013C)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(購自上海碧云天生物科技有限公司，批號：P0012)；SLC7A11抗體(購自美國Affinity公司，批號：AF6139)；GPX4抗體(購自美國Affinity公司，批號：AF0120)；Nrf2抗體(購自美國Affinity公司，批號：AF9294)。Annexin V-PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒(購自上海經科化學科技，批號：AD10-2)。

1.3.2 實驗設備 小動物呼吸機[世聯博研(北京)科技有限公司生產，型號：SAR-830/Ap]；低溫高速離心機(賽默飛生產，型號：Sorvall Stratos)；酶標儀(美國Molecular device公司生產，型號：pectramax M5)；高速組織研磨儀(武漢谷歌生物科技有限公司生產，型號：IS2000MM)；電泳儀(美國Bio-Rad公司生產，型號：Powerpac Universal)；電子秤(上海耀壯檢測儀器設備有限公司生產，型號：PL303-IC)；透射電子顯微鏡(日本JEOL公司生產，型號：JEM-2000Ex)；熒光顯微鏡(奧林巴斯生產，型號：CX23BG)。

1.4 實驗藥物

1.4.1 藥物制備 鹿紅方由上海中醫藥大學附屬曙光醫院制劑室提供，由鹿角片、紅花、仙靈脾、補骨脂、女貞子、山萸肉、沉香按15∶9∶30∶20∶30∶15∶6 比例配制。鹿紅方水提物制備方法如下：將藥材置于不銹鋼鍋中，加適量水浸泡1 h，置于電磁爐上，先用大火煮沸后，再用小火保持微沸煎煮1 h，18層紗布過濾，濾液備用；另外再加適量水同法再煎煮1次，18層紗布濾過，合并兩次藥液，于60 ℃旋轉蒸發儀減壓濃縮至干，在60 ℃真空干燥，干膏稱重，再碾為均勻細粉，制成干燥浸膏粉備用。

1.4.2 鹿紅方含藥血清的制備 將20只清潔級健康成年雄性SD大鼠適應性喂養1周后，灌服鹿紅方藥液，灌胃藥液各中藥含量為：鹿角0.15 g/mL，紅花0.09 g/mL，補骨脂0.2 g/mL，仙靈脾0.3 g/mL，女貞子0.3 g/mL，山萸肉0.15 g/mL，沉香0.06 g/mL，每次20 mL/kg，每日1次，連續灌胃5 d，在最后1 d灌胃1 h后用水合氯醛麻醉，經腹主動脈取血，進行血清分離，56 ℃水浴加熱30 min滅活，-20 ℃保存備用。

1.5 造模及干預方法

1.5.1 實驗動物分組與造模 將40只SPF級Wistar雄性大鼠隨機分為對照組、缺血再灌注模型組(模型組)、鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組，每組8只。按大鼠和人的換算量灌胃給予對應藥物(低劑量=人給藥劑量/體重×6.25)，中、高劑量分別為低劑量的2倍及4倍。鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組分別給予鹿紅方干燥浸膏粉劑量2.1 g/kg、4.2 g/kg、8.4 g/kg灌胃，對照組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，持續灌胃7 d，最后1次給藥后12 h行缺血再灌注造模。結扎大鼠前降支30 min后復灌24 h后結束造模[12]，對照組除不結扎前降支外，余操作同前。

1.5.2 H9c2 心肌細胞缺氧/復氧模型構建 將H9c2心肌細胞分為對照組、模型組、鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組。鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組加入6%、12%、18%鹿紅方含藥血清預處理24 h。缺氧/復氧處理：將模型組、鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組細胞培養液更換為不含胎牛血清的培養液，將細胞培養板水平放置，滴入2 mL左右的液體石蠟，分別封閉12 h進行缺氧處理后，吸除石蠟，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，更換為含有10%胎牛血清培養基，置培養箱培養4 h即為復氧。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 大鼠心肌梗死面積測定 各組大鼠復灌24 h結束造模后，取出大鼠心臟，PBS洗凈，置于-80 ℃冰箱30 min后取出，從心尖向心底部方向連續切成2 mm左右的薄片，將薄片放入2%TTC溶液中，37 ℃預熱；放入裝有10%甲醛的離心管中過夜，將心臟切片按照一定順序拍照，Image J軟件分析心肌梗死面積，紅色區代表非梗死心肌組織，白色區代表梗死心肌。心肌梗死面積=梗死心肌面積/左心室面積。

1.6.2 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察各組大鼠心肌組織病理學改變 各組取出大鼠心臟，預冷PBS洗凈，4%的多聚甲醛室溫固定24 h后取出，逐級乙醇脫水，石蠟包埋并切成6 μm左右的切片。切片烘干后脫蠟、乙醇水化處理。以蘇木精染色10 min，1%伊紅染色3 min，經二甲苯透明化、樹脂封片，光鏡下觀察心肌形態。

1.6.3 DNA 斷裂的原位末端標記(TUNEL)染色觀察并檢測各組大鼠心肌細胞凋亡情況 取出大鼠心臟，預冷PBS洗凈，4%的多聚甲醛室溫固定24 h，冰凍切片，經二甲苯浸洗，逐級乙醇脫水，雙氧水-甲醇浸泡，在0.1%TritonX-100、0.1%緩沖液固定5 min，PBS反復漂洗3次后加入TUNEL液，反應1 h，PBS漂洗，逐級乙醇脫水，經二甲苯透明化、樹脂封片，在熒光顯微鏡下觀察各組心肌細胞凋亡情況。

1.6.4 血清SOD、MDA、GSH和Fe2+水平檢測 10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，靜置后，3 500 r/min離心25 min，-80 ℃保存。采用比色法檢測各組小鼠血清中SOD、MDA、GSH及Fe2+水平，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

1.6.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測Nrf2和Keap-1蛋白表達水平 全自動蛋白印跡定量分析系統檢測主動脈組織中Nrf2、Keap-1蛋白表達水平。取大鼠主動脈組織，培養H9c2心肌細胞，取上清液，使用蛋白提取試劑盒提取蛋白，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離得到的蛋白通過濕法轉移到疏水性的聚偏二氟乙烯膜；用轉移到膜上的蛋白當作抗原，使之與第一抗體相結合后再與熒光標記的第二抗體雜交結合，最后通過底物顯色以檢測目的蛋白的表達水平。將導出的圖片用Image J軟件進行掃描，得到蛋白條帶灰度值，然后計算出每個蛋白條帶對應的蛋白表達量，將所得數值用GraphPad Prism軟件繪制出不同蛋白表達量的統計圖。

1.6.6 細胞增殖毒性檢測(CCK-8)法檢測細胞存活 PBS清洗培養皿，胰酶消化細胞，將細胞懸液接種于96孔板上，每孔約100 μL，每孔加入10 μL CCK-8溶液。在37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內孵育2 h。酶標儀檢測吸光度(波長45 mm)。

1.6.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集細胞培養液上清液，胰酶消化細胞，觀察到貼壁細胞開始脫落時終止消化。1 000 r/min離心5 min，棄去培養液。取細胞懸液195 μL，加入5 μL細胞凋亡檢測試劑混勻，1 000 r/min離心5 min沉淀細胞，加入10 μL 水溶性染色劑4 ℃避光下孵育20 min，流式細胞檢測細胞凋亡。

1.6.8 H9c2心肌細胞培養基中MDA、SOD、LDH含量檢測 低速離心取培養液上清液，采用試劑盒法檢測培養液中LDH含量，采用比色法檢測心肌細胞內MDA含量，采用黃嘌呤氧化法檢測心肌細胞內SOD含量。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積比較 與對照組比較，模型組心肌梗死面積明顯增大，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組心肌梗死面積減小，差異有統計學意義(P<0.05)。與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組心肌梗死面積減小，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s)

2.2 各組大鼠心肌組織病理學改變 HE染色光鏡觀察，對照組大鼠心肌細胞結構完整，排列整齊清晰，細胞間質無水腫，橫紋肌規則且清晰。模型組大鼠心肌細胞腫脹，排列紊亂，部分核膜破裂、消失，可見心肌細胞呈現凋亡狀態，出現炎性細胞浸潤；鹿紅方低劑量組可見心肌細胞腫脹，排列不規則，間質水腫及細胞外基質增多，并由炎性細胞浸潤；鹿紅方中、高劑量組心肌細胞腫脹減輕，排列較規則，炎性細胞浸潤明顯減少，細胞凋亡狀態明顯改善。詳見圖1。

2.3 各組大鼠血清氧化因子比較 與對照組比較，模型組血清SOD、GSH含量減低，血清MDA含量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組血清SOD、GSH水平升高，血清MDA含量減低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組血清SOD、GSH水平升高，血清MDA含量降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。提示心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞內抗氧化作用減少，細胞修復功能受損，脂質過氧化作用增強。鹿紅方低、中、高劑量預處理能有效減少心肌缺血再灌注損傷心肌組織中MDA生成，提高SOD、GSH含量，減少細胞氧化應激反應，維持細胞氧化和抗氧化水平平衡，以鹿紅方中、高劑量預處理效果最優。

表2 各組大鼠血清SOD、MDA、GSH含量比較 (±s)

2.4 各組大鼠心肌凋亡情況比較 TUNEL染色顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高，實驗造模成功。與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低；與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中、高劑量組大鼠心肌細胞凋亡率進一步降低。詳見圖2。提示心肌缺血再灌注導致心肌細胞凋亡，鹿紅方低、中、高劑量預處理均能減少心肌缺血再灌注導致的心肌細胞凋亡，以鹿紅方中、高劑量效果最明顯。

圖2 鹿紅方H/R誘導對心肌細胞凋亡的影響

2.5 各組H9c2心肌細胞的存活率比較 通過CCK-8檢測發現，與對照組比較，模型組H9c2心肌細胞存活率明顯降低，實驗造模成功。與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組H9c2心肌細胞存活率均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組H9c2心肌細胞存活率較高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。提示缺氧/復氧導致H9c2心肌細胞存活率下降，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組預處理均能增加缺氧/復氧H9c2心肌細胞存活率，以鹿紅方中、高劑量組最有效。

表3 各組H9c2心肌細胞存活率比較 (±s)

2.6 各組H9c2心肌細胞凋亡情況比較 在流式細胞散點圖上，以膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V)為橫軸，碘化丙淀(PI)為縱軸，左下象限顯示正常細胞，右上象限是凋亡中晚期和壞死細胞，即細胞凋亡情況。通過流式細胞檢測發現，與對照組比較，模型組H9c2心肌細胞凋亡明顯升高，顯示造模成功；與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組H9c2心肌細胞凋亡均有所降低，以鹿紅方中、高劑量組降低最明顯(見圖3)。提示缺氧/復氧導致H9c2心肌細胞凋亡，鹿紅方低、中、高劑量預處理均能減低缺氧/復氧H9c2心肌細胞凋亡，以鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組最明顯。

圖3 流式細胞術檢測各組H9c2心肌細胞凋亡情況

2.7 各組H9c2心肌細胞中SOD、MDA含量與H9c2心肌細胞培養上清液中LDH含量比較 與對照組比較，模型組H9c2心肌細胞中MDA含量升高、SOD含量下降，上清液中LDH含量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組MDA含量下降、SOD含量升高，上清液中LDH含量降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組H9c2心肌細胞中MDA含量下降，SOD含量升高，上清液中LDH含量下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。提示缺氧/復氧后H9c2心肌細胞內抗氧化作用減少，細胞修復功能受損，脂質過氧化作用增強，鹿紅方低、中、高劑量預處理能有效減少細胞內MDA生成，提高SOD含量及降低上清液中LDH含量，減少細胞氧化應激反應，減輕心肌細胞膜受損程度，維持細胞氧化和抗氧化水平平衡，以鹿紅方中、高劑量預處理效果最優。詳見表4。

表4 各組H9c2心肌細胞中SOD、MDA，上清液中LDH含量比較 (±s)

2.8 各組大鼠梗死心肌組織及H9c2心肌細胞中Keap1、Nrf2蛋白表達比較 通過對大鼠梗死心肌組織與H9c2心肌細胞中蛋白檢測發現，與對照組比較，模型組Keap1蛋白表達增高，Nrf2蛋白表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組Keap1蛋白表達降低，Nrf2蛋白表達增高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組Keap1蛋白表達降低，Nrf2蛋白表達增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。提示小鼠缺血再灌注損傷心肌與缺氧/復氧H9c2心肌細胞抗氧化應激水平降低，鹿紅方低、中、高劑量預處理能增加Nrf2蛋白表達，增加抗氧化應激水平，以鹿紅方中、高劑量組最有效。詳見圖4、表5、表6。

圖4 心肌組織與H9c2心肌細胞中Keap-1、Nrf2蛋白定量條帶圖

表5 各組大鼠心肌組織中Keap-1、Nrf2蛋白表達比較 (±s)

表6 各組H9c2心肌細胞中Keap-1、Nrf2蛋白表達比較 (±s)

2.9 各組大鼠心肌組織及H9c2心肌細胞中Fe2+水平比較 與對照組比較，模型組梗死心肌組織中Fe2+水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組Fe2+水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組Fe2+水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表7。提示心肌缺血再灌注受損心肌組織中Fe2+沉積，可能是導致心肌再灌注損傷的原因，鹿紅方低、中、高劑量預處理能有效減少梗死心肌組織中Fe2+沉積，以鹿紅方中、高劑量預處理效果最優。

表7 各組大鼠心肌組織中Fe2+濃度比較(±s) 單位：mmol/L

與對照組比較，模型組缺氧/復氧H9c2心肌細胞中Fe2+水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組缺氧/復氧H9c2心肌細胞Fe2+水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組缺氧/復氧H9c2心肌細胞Fe2+水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表8。提示缺氧/復氧H9c2心肌細胞中Fe2+離子沉積，可能是導致心肌細胞缺氧/復氧損傷的原因，鹿紅方低、中、高劑量預處理能有效減少缺氧/復氧H9c2心肌細胞中Fe2+沉積，以鹿紅方中、高劑量預處理效果最優。

表8 各組H9c2心肌細胞中Fe2+濃度比較(±s) 單位：mmol/L

3 討 論

AMI是臨床上常見的危急重癥，中醫上歸屬于“胸痹”“真心痛”范疇，基本病因多為本虛標實，正氣虧虛，氣滯、寒凝、痰濁、瘀血等痹阻心脈[12]。鹿紅方由鹿角、紅花、山茱萸、沉香等藥物組成，方中鹿角溫補肝腎、益精養血，紅花活血化瘀、通經止痛，共為君藥；山茱萸、補骨脂溫補腎陽，女貞子滋補肝腎，寓“陰中求陽”之義，為臣藥；少佐沉香溫經行氣止痛，增強紅花活血化瘀之功，具有“補中寓行、補而不滯”的作用。前期研究證實，鹿紅方可通過減輕氧化應激反應，抑制心肌細胞凋亡及自噬，從而減輕H9c2心肌細胞的缺氧/復氧損傷[13-14]。

MIRI的病理機制涉及氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等多方面，在MIRI的發生發展中都起重要作用。當MIRI發生時，心肌內產生大量的活性氧(ROS)，導致線粒體損傷、鈣超載、細胞凋亡，所有氧化應激是MIRI發生的關鍵環節。ROS升高導致心肌細胞凋亡和壞死[3，15]。本研究證明，H9c2心肌細胞缺氧復氧模型中，與對照組比較，模型組心肌細胞培養基上清液H9c2心肌細胞中LDH含量明顯升高，心肌細胞中MDA含量升高，SOD含量降低，而鹿紅方可有效降低細胞培養基中LDH及心肌細胞中MDA含量，升高SOD含量，以鹿紅方中劑量及高劑量組效果最優。在MIRI模型中，與對照組比較，模型組GSH、SOD含量明顯減低，MDA含量明顯升高，而鹿紅方可以有效降低梗死心肌組織MDA含量，升高SOD及GSH活性，以鹿紅方中劑量及高劑量組效果最優。此外，HE染色及TUNEL染色表明，鹿紅方低、中、高劑量都能有效緩解MIRI導致的心肌細胞水腫、壞死及凋亡。流式細胞檢測表明，鹿紅方各劑量能抑制H9c2缺氧/復氧心肌細胞凋亡，表明鹿紅方可以通過抑制氧化應激反應從而減輕心肌缺血再灌注損傷。

在缺血再灌注損傷過程中，氧化應激過程是關鍵環節[16]，而Keap-1/Nrf2/ARE信號通路是機體中最重要的抗氧化信號通路，Nrf2因子是機體內維持氧化還原反應的主要因子之一[6]，當細胞內氧自由基增加時，Nrf2從Keap-1上撤離，移位至細胞核，與ARE結合，啟動下游抗氧化蛋白及解毒酶，從而發揮抗氧化作用。本研究表明，在H9c2心肌細胞缺氧/復氧模型及MIRI模型中，與對照組比較，模型組Nrf2蛋白表達水平降低，鹿紅方各劑量都能上調Nrf2蛋白表達水平，增強抗氧化作用，以鹿紅方中劑量及高劑量效果最優。因此，鹿紅方可以上調Nrf2抗氧化信號通路，抑制氧化應激反應。

綜上所述，鹿紅方可以明顯抑制心肌缺血再灌注損傷導致的氧化應激反應，減輕心肌損傷，其機制可能與上調Nrf2抗氧化信號通路有關。此外，本實驗發現，與對照組比較，模型組心肌細胞及心肌組織中Fe2+含量明顯升高。而Fe2+水平升高導致細胞脂質過氧化可以引起細胞鐵死亡的發生。此外，鐵死亡相關蛋白的表達受Nrf2水平調控[6]。因此，鹿紅方減輕心肌缺血再灌注損傷的機制是否與鐵死亡相關，尚需進一步的實驗研究證明。