基于細胞焦亡NF-κB信號通路探討黃連解毒湯干預動脈粥樣硬化斑塊的作用機制

劉永瑞，唐 娜，王 林，葉伯鑫，劉 南

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是導致心血管疾病發生的主要因素，動脈粥樣硬化斑塊主要分布于由內皮細胞、血管平滑肌細胞和其他血管細胞組成的大、中型血管[1]。炎癥在動脈粥樣硬化形成中發揮關鍵作用，而促炎因子水平被認為是重要的預后因素，與動脈粥樣硬化進程明顯相關[2-3]。研究表明，細胞焦亡(Caspase-1依賴型細胞死亡)參與了多種疾病的病理生理過程，其本質為慢性炎癥[4]。炎性小體為炎癥通路的重要組成部分，其可通過核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路激活Caspase-1導致細胞焦亡[5]，并刺激促炎細胞因子(如白細胞介素、腫瘤壞死因子-α等)的成熟和分泌，有望成為動脈粥樣硬化的有效治療靶點。黃連解毒湯為清熱解毒的代表方，以黃連為君，清熱瀉火解毒，清心火及中焦之火；以黃芩為臣，清上焦之火及肺熱；以黃柏為佐，清下焦火熱；梔子為使，清瀉上中下三焦之火，四藥配伍，共奏清熱瀉火解毒之功。研究表明，黃連解毒湯具有抗菌抗炎、抗氧化應激、抗動脈粥樣硬化[6-8]等多方面作用，但治療機制仍未完全明確。

本研究采用蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察新西蘭兔主動脈斑塊情況，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測新西蘭兔血清炎性因子水平，免疫組化(IHC)法、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)法、蛋白免疫印跡(Western Blot)法評估細胞焦亡水平，從細胞焦亡角度評估黃連解毒湯對動脈粥樣硬化穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥物

1.1.1 實驗動物 雄性新西蘭兔60只，體質量2.0～3.0 kg，購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK(粵)2019-0035。飼養于廣州中醫藥大學第一附屬醫院實驗中心，許可證號為：SCXK(粵)2018-0092。

1.1.2 試驗藥物 黃連解毒湯由黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g組成，購于廣州中醫藥大學第一附屬醫院藥房，代煎后分裝，于冰箱中冷藏。

1.1.3 實驗試劑 細胞焦亡抑制劑VX-765(購于MedChemExpress公司，No.HY-13205)，脂多糖(LPS)(購于Sigma公司，No.L2880)，維生素D3注射液(購于上海通用藥業股份有限公司，國藥準字H31021259)，C反應蛋白(CRP)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(購于Abcam公司，ab157726)，白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(購于Abcam公司，Ab273237)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(購于武漢菲恩生物科技有限公司，ERB0126)，轉化生長因子-β(TGF-β)ELISA試劑盒(購于武漢菲恩生物科技有限公司，ERB0119)，白細胞介素-18(IL-18)ELISA試劑盒(購于武漢菲恩生物科技有限公司，ERB0059)，RNA提取試劑盒(購于Takara公司，9676)，預混SYBR?Green 聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒(購于Takara公司，RR820A)，IL-1β抗體(購于北京博奧森生物技術有限公司，bs-0812R)，IL-18抗體(購于北京博奧森生物技術有限公司，bs-20159R)，Caspase-1抗體(購于武漢三鷹生物技術有限公司，22915-1-AP)，NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)抗體(購于武漢三鷹生物技術有限公司，19771-1-AP)，辣根過氧化物酶(HRP)山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(購于Abcam公司，ab6721)，二喹啉甲醇(BCA)試劑盒(購于上海碧云天生物技術有限公司，P0010)，p50抗體(購于北京博奧森生物技術有限公司，bs-1194R)，p65抗體(購于北京博奧森生物技術有限公司，bs-0465R)，核因子kB抑制蛋白α(IkBα)抗體(購于北京博奧森生物技術有限公司，bs-1287R)，β-actin抗體(購于Abcam公司，ab8224)。

1.2 動脈粥樣硬化模型的建立與藥物干預 將雄性新西蘭兔隨機分為6組，即空白組、模型組、黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組、VX-765組，每組10只。采用高脂飼料[購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(粵)2019-05073]喂養聯合肌肉注射LPS(第4周、第8周、第12周，于新西蘭兔右側耳動脈、頸動脈和股淺動脈旁注射LPS，每個部位肌內注射1 μg)及腹腔注射維生素D3(喂養前一次性給藥2×105U/kg)的復合方法進行造模。除空白組外，其余5組均給予復合方法進行造模。從第8周開始黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組分別給予黃連解毒湯每天0.75 g/kg、1.50 g/kg和3.00 g/kg灌胃，VX-765組給予氯喹[VX-765溶于二甲基亞砜(DMSO)溶液中]50 mg/kg腹腔注射，空白組與模型組每天給予等容生理鹽水灌胃，以上操作連續干預至16周末后，用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，采用腹主動脈取血休克法處死新西蘭兔，分離主動脈組織。

1.3 ELISA法檢測血清炎性因子水平 ELISA法檢測血清炎性因子CRP、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-18水平，將所有試劑平衡至室溫18～25 ℃，設定標準孔、待測樣品孔、空白孔，并按說明書要求分別加入相應試劑，加上覆膜，37 ℃孵育1 h，按說明書要求加相應試劑并用酶標儀檢測。

1.4 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察主動脈組織斑塊情況 將從新西蘭兔分離的主動脈組織置于石蠟包埋盒中，并于流水中沖洗3 h充分洗去組織表面甲醛。沖洗后將組織放入脫水機行梯度乙醇脫水與浸蠟。包埋后進行組織切片脫蠟至水，蘇木素與伊紅染色，隨后行脫水透明，封片晾干。在顯微鏡下對主動脈病變情況進行組織學評估。

1.5 細胞焦亡水平測評

1.5.1 RT-qPCR法檢測Caspase-1、NLRP3基因表達 采用RNA提取試劑盒(Takara，Ostu，Japan)按照說明書步驟操作從新西蘭兔主動脈組織中提取總RNA，并逆轉錄成cDNA。使用預混SYBR?Green PCR試劑盒進行實時PCR反應。特異性引物(見表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴增條件為95 ℃作用30 s，95 ℃作用5 s(40個循環)，60 ℃作用30 s，用相對定量的2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。

表1 引物序列(5′→3′)

1.5.2 IHC法檢測IL-1β、IL-18、Caspase-1、NLRP3表達水平 石蠟切片脫蠟至水，步驟同HE染色。將切片放入抗原修復盒中，置微波爐中92～99 ℃加熱1 min后冷卻至室溫，3%過氧化氫處理祛除內源性過氧化物酶，5%山羊血清封閉30 min后滴加相應一抗IL-1β(1∶500)、IL-18(1∶500)、Caspase-1(1∶200)，NLRP3(1∶200)，4 ℃過夜。復溫至室溫，滴加HRP山羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育30 min。滴加3，3-N-二氨基聯苯胺四鹽酸(DAB)顯色液，顯色完成后放入水中終止，蘇木素染核，脫水透明，封片、晾干，顯微鏡下觀察拍照，采用Image-Pro Plus軟件分析。

1.5.3 Western Blot法檢測Caspase-1、NLRP3蛋白表達及 NF-κB信號通路關鍵蛋白表達 從新西蘭兔主動脈組織中提取的蛋白質樣品，使用BCA蛋白質定量試劑盒對蛋白質濃度進行定量后，經10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，用稀釋的Caspase-1(1∶1 000)、NLRP3(1∶1 000)、p50(1∶1 000)、p65(1∶1 000)、IkBα(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗孵育4 ℃過夜。第2天取出并用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后，在室溫下滴加HRP山羊抗兔IgG(1∶5 000)二抗孵育1 h。隨后，滴加顯影液在化學發光成像儀顯影，用Image J軟件分析條帶灰度值，確定各蛋白的相對比例。

2 結 果

2.1 各組血清炎性因子水平比較 與空白組比較，模型組CRP、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-18水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組、VX-765組CRP、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-18水平明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.01)；與黃連解毒湯低、中劑量組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組CRP、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-18水平明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.01)；且VX-765組較黃連解毒湯高劑量組IL-1β、IL-18下降更明顯，差異均有統計學意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 各組新西蘭兔血清炎性因子水平比較 (±s)

2.2 HE染色主動脈斑塊情況 新西蘭兔主動脈HE染色中模型組斑塊形成明顯，提示通過聯合喂養高脂飼料、肌肉注射LPS及腹腔注射維生素D3方法建立新西蘭兔動脈粥樣硬化模型造模成功。HE染色結果顯示，黃連解毒湯各劑量組主動脈粥樣硬化斑塊較模型組減少，提示黃連解毒湯可以拮抗高脂等復合因素導致動脈粥樣硬化斑塊的形成，發揮穩定斑塊及延緩動脈粥樣硬化進展的作用，且以黃連解毒湯高劑量組最為明顯，其效果與VX-765大致相當。詳見圖1。

圖1 各組新西蘭兔主動脈HE染色(×2)

2.3 細胞焦亡水平

2.3.1 各組IL-1β、IL-18、Caspase-1、NLRP3表達水平比較 與空白組比較，模型組IL-1β表達水平明顯上調，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組、VX-765組IL-1β表達水平下調，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與空白組比較，模型組IL-18表達水平明顯上調，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組IL-18表達水平下調，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與空白組比較，模型組Caspase-1表達水平明顯上調，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組Caspase-1表達水平下調，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與空白組比較，模型組NLRP3表達水平明顯上調，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組、VX-765組NLRP3表達水平明顯下調，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖2、圖3。

圖2 各組新西蘭兔主動脈斑塊IHC染色后表達情況(×20)

模型組與空白組比較，＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.05，△ P<0.01。

2.3.2 各組Caspase-1、NLRP3基因表達水平比較 RT-qPCR結果提示，與空白組比較，模型組Caspase-1、NLRP3基因相對表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組、VX-765組Caspase-1基因相對表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組NLRP3基因相對表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。詳見圖4。

模型組與空白組比較，＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.01。

2.3.3 各組Caspase-1、NLRP3蛋白表達水平比較 Western Blot結果提示，與空白組比較，模型組Caspase-1、NLRP3蛋白相對表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組Caspase-1、NLRP3蛋白相對表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖5、圖6。

圖5 各組新西蘭兔主動脈Caspase-1、NLRP3蛋白表達電泳圖

模型組與空白組比較，＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.01，△ P<0.01。

2.4 各組NF-κB通路蛋白相對表達量比較 Western Blot結果提示，與空白組比較，模型組p50、p65蛋白相對表達水平明顯升高，IkBα蛋白相對表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組p50蛋白相對表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組、VX-765組p65蛋白相對表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組IkBα蛋白相對表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖7、圖8。

圖7 各組NF-κB信號通路蛋白表達電泳圖

模型組與空白組比較，＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.05，△ P<0.01。

3 討 論

動脈粥樣硬化的發生始于血管內皮功能障礙，影響諸多病理生理過程如血管炎癥、血管張力、線粒體功能、氧化應激等。其中，炎癥在動脈粥樣硬化進程中發揮重要作用[9]，炎性細胞作為早期效應分子，分泌促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β等)進一步加速病變進展，導致斑塊破裂、血栓形成，甚至發生急性冠脈綜合征[2]。研究表明，急性心肌梗死早期伴有血清TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β水平明顯增加，促炎因子的分泌直接影響梗死區心肌細胞的存活及凋亡[10]。IL-6與腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)的相互作用被認為是動脈粥樣硬化的重要發病機制，可誘導氧化應激和內皮功能障礙[11]。在心肌梗死后期，炎性因子的持續增加促進間質纖維化和非梗死區膠原沉積，導致心室功能障礙[12]。炎性因子累積可誘導梗死區局部基質金屬蛋白酶和利鈉肽表達，促進心臟重構[13]。促炎因子水平被認為是重要的預后因素，與動脈粥樣硬化進程明顯相關。研究證明，IL-1β可通過調控單核細胞功能誘導IL-10水平升高，并減小動脈粥樣硬化斑塊面積[14]。黃連解毒湯可通過降低動脈粥樣硬化病人機體炎性因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α的表達水平，縮小動脈血管內中膜厚度和斑塊面積[8]。本研究通過構建新西蘭兔動脈粥樣硬化模型，評估黃連解毒湯對動脈粥樣硬化炎癥水平的影響。結果表明，黃連解毒湯具有明顯的抗炎作用，黃連解毒湯中、高劑量可降低兔血清炎性因子CRP、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-18水平。

動脈粥樣硬化是一個多步驟過程，包括4個主要階段：內皮損傷、泡沫細胞形成、血管平滑肌細胞增殖、動脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂。同時，斑塊易損特征被證明與炎癥程度密切相關，抑制關鍵炎癥通路可減輕動脈粥樣硬化的發生與進展，并提高斑塊穩定性，可能成為靶向性治療策略。研究表明，組蛋白去乙酰化酶9(histone deacetylase 9，HDAC9)可促進血管系統的炎癥水平，并增強動脈粥樣硬化斑塊的易損性，其促炎效應可被選擇性炎癥通路抑制TMP195逆轉[15]。維生素E可通過炎癥信號通路調節脂質穩態和動脈粥樣硬化斑塊穩定性[16]。帕瑞昔布通過抑制炎癥和基質金屬蛋白酶的產生改善動脈粥樣硬化斑塊穩定性[17]。黃連解毒湯可調控腸道菌群抑制高脂飲食導致的小鼠非酒精性脂肪性肝病和動脈粥樣硬化斑塊的形成[7]。臨床數據表明，氧化應激和炎癥是年齡相關心血管功能障礙的驅動因素，在動脈粥樣硬化斑塊穩定和破裂中發揮重要作用[18]。本研究中，兔主動脈HE染色結果顯示，黃連解毒湯各干預組主動脈粥樣硬化斑塊較模型組明顯減少，提示黃連解毒湯可以拮抗高脂等復合因素導致動脈粥樣硬化斑塊的形成，發揮穩定斑塊及延緩動脈粥樣硬化進展的作用。

現階段，NLRP3為研究最廣泛的一類炎性小體。動脈粥樣硬化模型中NLRP3的主要成分(REF61)表達增加，抑制NLRP3炎性小體可降低載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化病變程度[19-20]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)通過結合巨噬細胞表面的CD36/TLR4/TLR6信號復合物，隨后誘導膽固醇結晶致巨噬細胞溶酶體損傷導致NLRP3炎性小體的激活[21]。來源于巨噬細胞或樹突狀細胞中的脂質積累可在多個環節誘導多蛋白復合物炎性小體，通過效應Caspase-1介導IL-1β和IL-18前體蛋白水解成為具有生物活性的IL-1β和IL-18釋放，激活下游炎癥通路并觸發細胞焦亡。外源性成纖維細胞生長因子21(FGF21)治療可明顯減少動脈粥樣硬化斑塊面積并改善血脂，在體內體外實驗中均可降低焦亡蛋白表達[22]。溶血磷脂酰膽堿誘導NLRP3炎性小體介導的IL-1β分泌觸發焦亡，促使人單核細胞和內皮細胞泡沫細胞形成[23]。黃連解毒湯可通過調控NLRP3炎性小體，降低小鼠動脈粥樣硬化模型主動脈組織中IL-1β、Caspase-1、NLRP3、TNF-α mRNA表達，從而發揮抗動脈粥樣硬化作用[24]。本研究使用細胞焦亡抑制劑VX-765進行干預，結果提示，抑制細胞焦亡可拮抗動脈粥樣硬化斑塊形成，并降低兔血清炎性因子CRP、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-18水平，且與高劑量黃連解毒湯比較，VX-765組在降低炎性因子IL-18及IL-1β水平上具有更好的治療效應。同時，高劑量黃連解毒湯與VX-765均可下調基因NLRP3、Caspase-1水平，并明顯降低焦亡蛋白IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1表達，二者無明顯差異，即黃連解毒湯可降低動脈粥樣硬化細胞焦亡水平，并起到抗炎作用，其效應與抑制劑VX-765相當。

為明確黃連解毒湯抑制焦亡的分子機制，本研究進一步驗證了代表性NF-κB炎癥通路下游蛋白表達水平。研究表明，轉錄因子NF-κB具有調控活性氧(ROS)產生、心肌細胞的存活與凋亡和心肌收縮性等功能[25-27]。亞基p65/p50磷酸化對NF-κB信號通路具有雙向調節的作用，取決于所涉及的激酶及特定殘基類型[28]。在冠狀動脈結扎的心肌梗死模型中，選擇性過表達IkBα抑制因子的轉基因小鼠生存率提高，心室重構、心肌收縮功能及肺功能改善，并與NF-κB p65活化、細胞因子水平和凋亡水平降低密切相關[29]。基于網絡藥理學分析顯示，黃連解毒湯可能通過NF-κB、MAPK、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、VEGF信號通路治療動脈粥樣硬化[30]。結合本研究結果，高劑量黃連解毒湯可降低通路中p50、p65蛋白表達，逆轉IkBα蛋白降低趨勢，且與VX-765組無明顯差異，提示黃連解毒湯可調節NF-κB通路，該通路可能為黃連解毒湯發揮抗炎及抗焦亡作用的關鍵途徑。

本研究通過構建新西蘭兔動脈粥樣硬化動物模型進行體內實驗，應用HE染色觀察主動脈斑塊情況，ELISA檢測炎性因子水平，IHC法、RT-qPCR法、Western Blot法從基因和蛋白水平評估細胞焦亡水平，較為全面地評估黃連解毒湯對動脈粥樣硬化穩定性的影響。結果表明，黃連解毒湯可通過調控細胞焦亡水平發揮穩定動脈粥樣硬化斑塊及抗炎作用，可能通過介導NF-κB信號通路實現，具體潛在分子機制需進一步研究驗證。