膿毒癥心肌功能障礙關鍵基因的篩選及生物信息學分析

蔣萬威 楊國輝

貴州醫科大學臨床醫學院，貴州貴陽 550004

膿毒癥心肌功能障礙（sepsis-induced myocardial dysfunction，SIMD）是因膿毒癥導致的心臟收縮或舒張功能下降，是膿毒癥常見的器官功能障礙之一，與患者的生存風險顯著相關[1-3]。超過10%的SIMD 患者可進一步發展為膿毒癥性心肌病，長期影響患者心功能[4]。至今仍未完全闡明其具體的發病機制，多個潛在病理生理過程可能共同參與其中[5]。現階段多使用超聲多普勒、心肌標志物等輔助措施識別SIMD，但這些指標缺乏特異性，且尚無針對性的治療措施[6-8]。本研究通過分析高通量基因表達數據庫中的多個數據集，對差異表達的基因進行研究，以期發掘SIMD 潛在的研究方向。

1 資料與方法

1.1 基因表達數據集選擇

在高通量基因表達數據庫中檢索膿毒癥患者外周血轉錄組數據集及SIMD 小鼠心肌組織轉錄組數據集（表1），為匹配膿毒癥患者外周血樣本選擇小鼠盲腸結扎穿孔術（cecal ligation and puncture，CLP）后24 h 的心肌轉錄組數據為研究對象。

表1 膿毒癥患者及膿毒癥心肌功能障礙動物模型數據集

1.2 差異基因篩選

人體以膿毒癥患者及健康受試者分組，小鼠以CLP 及假手術分組。使用R 軟件對各組數據集進行分析，采用P-Value＜0.05、Log2FC ＞1 為顯著性篩選條件，對小鼠共同差異基因進行同源轉換，提取膿毒癥患者與動物模型共同差異基因。見圖1。

圖1 膿毒癥心肌功能障礙差異基因篩選流程

1.3 差異基因生物功能分析

對膿毒癥外周血及SIMD 差異基因進行基因本體（gene ontology，GO）及京都基因和基因組數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。

1.4 篩選SIMD 關鍵基因

對膿毒癥患者差異基因進行加權基因共表達網絡分析（weighted correlation network analysis，WGCNA），以P ＜0.05 提取與臨床性狀顯著相關的基因模塊，篩選各基因模塊的前50 核心基因，同時定位SIMD 相關基因。

1.5 繪制蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡

利用STRING 數據庫對膿毒癥患者差異基因進行蛋白轉換，取中等置信度＞0.400 繪制PPI 網絡，篩選提取核心蛋白，并從中定位SIMD 相關蛋白。

2 結果

2.1 膿毒癥心肌損傷差異基因篩選結果

膿毒癥患者外周血及小鼠膿毒癥心肌組織分別有318 個及143 個共同差異基因，SIMD 差異基因占84 個，其中下調基因54 個，上調基因30 個。見圖2。

圖2 膿毒癥心肌功能障礙差異基因

2.2 膿毒癥心肌損傷差異基因GO 及KEGG 富集分析

膿毒癥及SIMD 差異基因集中在T 細胞、中性粒細胞、炎癥反應等生物學過程；兩者在細胞成分及分子功能中也有相似基因富集（圖3～4）。膿毒癥外周血與SIMD 差異基因在KEGG 富集分析中有較大差異（圖5～6）。

圖3 膿毒癥患者外周血差異基因基因本體富集分析

圖4 膿毒癥心肌功能障礙差異基因基因本體富集分析

圖5 膿毒癥患者外周血差異基因京都基因和基因組數據庫富集分析

圖6 膿毒癥心肌功能障礙差異基因京都基因和基因組數據庫富集分析

2.3 差異基因WGCNA 分析

休克、APPCHE Ⅳ評分、主要診斷與綠色及藍色基因模塊相關，28 d 存活率與棕色基因模塊相關，見圖7。IRAK3、ANXA3、S100A8、GADD45A、LCN2、MME、LTF、NLRP1、FGL2、GBP5、KLHL2、KIF1B 等 為SIMD的關鍵基因，見圖8。

圖7 膿毒癥患者外周血差異基因與臨床性狀特征的關系

圖8 膿毒癥心肌功能障礙基因相互作用關系

2.5 SIMD 關鍵蛋白

共轉化658 個蛋白，LTF、LCN2、SOCS3、ITGA4、TLR2、JAK2、FCER1G、ITGAM、IL1R1、CD74、CIITA、MMP9 為SIMD 的關鍵蛋白。見圖9。

圖9 膿毒癥心肌功能障礙蛋白質-蛋白質相互作用網絡

3 討論

多個病理生理過程參與了膿毒癥器官所致的損傷，免疫調節失衡是重要的機制之一[9-10]。通過基因富集分析發現，SIMD 差異基因同樣集中在免疫的調控中，這些差異基因與患者的臨床性狀顯著相關，提示免疫調節失衡是造成心肌損傷的主要原因[11-13]。

LCN2 和LTF 處于WGCNA 及PPI 網絡的核心位置。LCN2 是脂質運載蛋白之一，其通過限制細菌增殖發揮先天性免疫作用，是巨噬細胞及中性粒細胞分化所必須的關鍵基因，具有調節免疫及預防器官功能損傷的作用[14-17]。LTF 在機體應激時可發揮免疫調節作用，其參與了NF-κB 和TLR4 等炎癥信號通路的傳導[18-20]。在膿毒癥患者及動物模型中，LCN2 及LTF 在24 h 內顯著升高，與膿毒癥患者呼吸衰竭、APACH Ⅳ評分、休克等有著高度相關性，可能是SIMD 的關鍵標志物之一。ANXA3 及S100A8 同樣參與炎癥反應的調控，沉默前者可減輕炎癥反應[21]，而后者可改善膿毒癥所導致的心肌重構，減輕心肌損傷[22-23]。KLHL2 則參與抗原加工呈遞及先天性免疫系統過程[24-26]。

SOCS3 同樣是調節免疫反應的重要基因之一，其接受多種細胞因子的刺激，發揮抑制免疫反應的作用[27-28]。一項死亡患者心肌組織的研究中發現，區別于擴張型心肌病及缺血性心肌病，SOCS3 在膿毒癥患者心肌組織內呈高表達趨勢，具有特異性[29]。而該基因在膿毒癥外周血中具有同樣趨勢，可能有利于對SIMD的鑒別[30]。

綜上所述，本研究聯合研究多個SIMD 動物及膿毒癥患者的轉錄組基因數據集，LCN2、LTF、ANXA3、S100A8、KLHL2、SOCS3 是SIMD 潛在的關鍵基因，在臨床診斷、預后判斷及治療等方面具有重要意義。