基于網絡藥理學探討五苓散治療腦積水的作用機制

蘇 丞，孫雙喜，孟苗苗，徐祿玉，萬 燦，黃 燕

腦積水是世界范圍內最常見的神經外科疾病，腦積水是由于腦脊液的產生和吸收失衡或其通路受阻所致，導致腦脊液充滿的腦室擴張和顱內壓升高。腦積水通常需手術治療，但術后并發癥較多，復發率較高。目前，內科藥物治療、中西醫治療尚無特效藥物，多采用對癥干預，其中，甘露醇是最常見的脫水藥，但長時間使用副作用大。研究表明，炎癥反應與腦積水的發病機制有關[1]。

五苓散是治療水液代謝異常的基本方，出自《傷寒雜病論》，由茯苓、澤瀉、豬苓、白術、桂枝組成，有健脾利水、溫陽化氣的功效，小便不利、水腫、口渴、體液停留、嘔吐、腹瀉、頭暈、頭重等主證表現與神經系統相關疾病腦積水有相同之處。多項研究表明，五苓散對于腦積水及正常顱壓腦積水有較好的療效，同時可減少并發癥[2-7]。中藥復方具有多成分、多靶點、多通路的特點，且具有整體性和系統性，在干預具有多細胞、多因子共同參與調控的復雜病理生理過程中具有獨特的優勢[8]。網絡藥理學利用計算機技術，系統全面地觀察藥物和疾病之間潛在的關系并進行可視化分析，有助于揭示中藥復方的科學內涵、發現藥物靶標、傳承和發展中醫藥理論[9]。本研究運用網絡藥理學方法，系統地闡述五苓散治療腦積水的作用機制，以期為臨床及基礎研究提供新思路[10-11]。

1 資料與方法

1.1 成分靶點信息查詢 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺數據庫(TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索五苓散中5種中藥豬苓、澤瀉、桂枝、茯苓和白術的成分，成分的篩選條件設置為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18。將所獲得的成分通過TCMSP數據庫和Swisstargets數據庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)獲得成分靶點。

1.2 疾病靶點查找 以“Hydrocephalus”為關鍵詞，在基因名片數據庫(GeneCards，https：//www.genecards.org/)和 美國國立生物技術信息中心(NCBI)數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行人類基因檢索。

1.3 關鍵靶點篩選及蛋白相互作用(PPI)網絡構建 采用R3.6.3軟件將五苓散化學成分作用靶點和腦積水相關的疾病靶點進行映射構建韋恩圖。存在交集的共同靶點可能是五苓散中活性成分治療腦積水的關鍵靶點。將藥物疾病共有靶點輸入STING數據庫(https：//string-db.org/cgi/input.pl)進行PPI網絡的構建，將生物種類設定為“homo sapiens”，最小互相作用閾值設定為“highest confidence”(>0.9)，其余設置均為默認設置，獲得 PPI 網絡。

1.4 靶點通路注釋分析 對篩選出的共同靶基因進行基因本體(GO)功能注釋和京都基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，對所預測的化學成分靶點進行富集分析，采用R 3.6.3 軟件進行可視化處理，分析五苓散治療腦積水可能的生物過程和信號通路。

1.5 化學成分-交集基因-通路網絡構建 根據上述化學成分的靶點預測結果，采用Cytoscape 3.8.0軟件構建藥物組-化學成分-交集靶點-通路網絡模型。在網絡中，用不同的形狀表示化學成分、交集基因、映射通路等信息，連接線表示兩節點間存在關聯或映射關系。

2 結 果

2.1 五苓散成分靶點信息 共篩選出五苓散中5味中藥50種類藥成分，其中，豬苓11個，白術7個，茯苓15個，桂枝7個，澤瀉10個。收集類藥成分的靶點信息，其中，豬苓181個，白術124個，茯苓186個，桂枝226個，澤瀉183個，去重后共獲得五苓散類藥成分的作用靶點335個。

2.2 腦積水疾病靶點的篩選及共同靶點PPI網絡構建 在GeneCards數據庫檢索到3 519個相關基因，OMIM-NCBI基因數據庫獲得70個相關基因，將這兩個數據庫的基因合并去重之后，獲得3 520個腦積水相關基因。采用R軟件制作3 520個疾病靶點與335個類藥成分作用靶點的韋恩圖，獲得疾病-類藥活性成分共同靶點105個(見圖1)。在STRING數據平臺輸入105個疾病與藥物共同靶點，分析后獲得PPI作用網絡，共獲得105個相互作用節點和1 147條相互作用關系(見圖2)。

圖1 疾病與藥物靶點韋恩圖

圖2 共同靶點PPI網絡圖

2.3 關鍵靶點GO生物功能注釋 應用R軟件中clusterProfiler包對五苓散成分-疾病的105個共同作用靶蛋白進行GO生物功能注釋，保留P≤0.01的結果，進行可視化分析，獲得GO分析柱狀圖(見圖3)。結果可見，共同作用靶點主要富集在類固醇代謝過程(steroid metabolic process)、小分子代謝過程的調節(regulation of small molecule metabolic process)、對氧化應激的反應(response to oxidative stress)、細胞對化學應激的反應(cellular response to chemical stress)、生殖結構發育(reproductive structure development)等。

圖3 共同靶點GO分析柱狀圖

2.4 KEGG通路富集分析 應用R軟件中clusterProfiler包對五苓散成分-疾病的105個共同作用靶蛋白進行KEGG通路富集分析，保留P≤0.01的結果，進行可視化分析，獲得KEGG通路富集氣泡圖(見圖4)。可見，共同靶點主要富集于癌癥中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、結核(tuberculosis)、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)。

圖4 KEGG通路富集氣泡圖

2.5 構建成分-靶點-通路網絡 應用Cytoscape 3.2.1軟件，構建出五苓散中藥-成分-靶點-信號通路網絡拓撲圖(見圖5)。使用network analyzer功能進行網絡特征分析，以度值(Degree)為評判標準可獲得較為重要的成分、靶點、通路。詳見表1。

圖5 中藥-成分-共同靶點-信號通路網絡圖

表1 關鍵成分信息表

3 討 論

腦積水是一種常見的神經系統疾病，但其發生原因復雜。研究發現，當腦組織損傷時，炎性細胞的炎性反應誘發室管膜瘢痕、腦室內阻塞，這些物質通過多種機制引起更多的細胞損傷和調亡，而許多抗炎藥物的相關研究也表明其對改善腦積水的有效性[12-14]。目前認為，腦積水的形成多為室管膜纖毛的功能障礙、水通道蛋白介導的高效跨膜和跨細胞水轉運腦脊液的循環障礙，還有出血后血紅蛋白降解物質堵塞腦脊液通路這3個主要原因[15-18]。

五苓散可以治療的疾病的臨床表現主要是水液代謝障礙，表現為頭痛發熱、口渴、水入即吐、吐涎沫而頭目眩暈、短氣而咳、小便不利、水氣上逆等；腦積水的典型癥狀為頭痛、嘔吐、視力模糊、視神經乳頭水腫、偶伴復視、眩暈及癲癇發作、血壓升高、呼吸紊亂、腦型鈉潴留及腦性耗鹽綜合征等，兩者在臨床表現上有很大的相同性。研究表明，桂枝具有抗病毒、抗菌、降糖、解熱、抗炎、抗敏、抗凝血、抗腫瘤、鎮靜、抗焦慮、擴血管、神經保護等作用[19-21]。白術的作用集中在胃腸道系統、免疫系統及泌尿系統，具有抗腫瘤、修復胃黏膜、抗炎鎮痛、調整水液代謝、保肝、改善記憶力、調節脂代謝、降血糖、抗血小板、抑菌、免疫調節等多種藥理作用[22-24]。而茯苓具有抗腫瘤、免疫調節、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用[25-27]。澤瀉具有利尿、抗結石及腎臟保護、降血脂及保肝、降血糖、抗癌、抗氧化損傷、抗炎、抗補體等多種藥理活性[28-29]。豬苓的藥理作用包括利尿、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調節、保肝、抑菌、促進頭發生長等[30-32]。

本研究中，通過中藥-成分-靶點-信號通路網絡拓撲分析后，紫杉林(taxifolin)、兒茶素[(+)-catechin]、表兒茶素(ent-Epicatechin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)為篩選后的主要活性成分，這些成分均來自桂枝。相關研究表明，桂枝提取物通過下調Toll樣受體4/髓樣細胞分化因子88(TLR4/MyD88)信號通路有效抑制小鼠小膠質細胞(BV2)中脂多糖(LPS)誘導的神經炎癥[33-34]。紫杉林具有抗氧化和抗炎作用[35]。兒茶素治療對創傷性腦損傷大鼠有神經保護作用，這些作用可能是通過干預血腦屏障破壞和過度炎癥反應的自我維持過程來實現的[36]。表兒茶素顯著刺激脾細胞增殖，可顯著增強自然殺傷(NK)細胞的細胞毒作用和巨噬細胞的吞噬功能，具有免疫調節活性[37]。β-谷甾醇通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(p38)、細胞外調節蛋白激酶(ERK)、核轉錄因子-κB(NF-κB)通路的激活而影響小膠質細胞的活性從而減輕炎癥反應[38]。此外，β-谷甾醇具有抑制血小板Aβ生成的潛在作用，可以改善粉樣前體蛋白/早老素1(APP/PS1)小鼠的記憶和學習障礙[39]。故五苓散可能通過上述核心成分的抗炎、抗氧化、免疫調節來治療腦積水。

在中藥-成分-靶點-信號通路的后續分析中，篩選出來的靶點有蛋白激酶 B信號1(AKT1)、白細胞介素6(IL6)、胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、重組人血管內皮生長因子(VEGFA)。絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶信號通路在T細胞的發育和存活過程中發揮至關重要的作用，與中樞神經系統的自身反應性免疫細胞有關[40]。AKT1對血管內皮細胞功能和壁細胞覆蓋的調節在血管生成過程中對血管成熟有重要作用[41]，AKT1可調節血管張力和缺血誘導的動脈形成[42]。

通過KEGG通路分析可知，五苓散主要通過蛋白聚糖通路來治療腦積水。蛋白多糖是細胞外基質的主要成分，是一組高度異質的蛋白質，其特征是糖胺多糖類型的特定線性碳水化合物鏈的共價連接，在細胞表面，這些分子調節細胞因子、趨化因子、生長因子、黏附分子的表達和活性，并作為信號輔助受體發揮作用[43]。蛋白多糖在神經組織發育中的作用因其高度調控的時空表達模式而受到越來越多的關注，其可促進/抑制軸突生長，參與各種前體細胞類型的指定和成熟，調節細胞的遷移、軸突尋路、突觸發生和可塑性等行為[44-45]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是細胞外信號向細胞內反應轉換的重要橋梁[46]。抑制p38MAPK信號通路可有效改善缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的學習記憶能力和運動功能，減少海馬區神經元凋亡，從而促進神經元的恢復[47]。此外，MAPK信號通路對血腦屏障的破壞有預防作用[48]。同時MAPK是缺血性和出血性腦血管疾病的重要調節因子[49]。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學的方法與技術，挖掘到五苓散中50種類藥性成分及335個潛在靶點，腦積水疾病相關靶點3 520個，其中五苓散-腦積水共同靶點105個，通過對這些靶點進行GO生物過程及KEGG信號通路的富集分析，初步預測出五苓散可能是通過調節AKT1、IL6、CASP3、MAPK3、VEGFA等靶點，調控癌癥中的蛋白聚糖、MAPK信號通路、乙型肝炎、結核、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染的信號通路對腦積水進行有效治療。網絡藥理學是通過計算機輔助技術研究數據庫相關聯系得來，得出的結果可作為后續研究的線索，為后續的臨床及實驗研究提供思路。