骨骼肌circRNA 在死亡時間推斷中的初步篩選及驗證研究

董婷婷，肖作潤，劉增甲，王業全，張國安，崔 文

（濟寧醫學院 法醫學與醫學檢驗學院，山東 濟寧 272067）

死亡時間或死后間隔時間（postmortem interval，PMI）是指尸體被發現時距離死亡時的時間間隔。死亡時間的準確推斷在可疑死亡案件中，對于排查和確定犯罪嫌疑人至關重要。 因此，死亡時間的推斷研究一直是法醫學研究的熱點，也是目前研究的難點。 傳統的法醫病理是通過尸斑、尸僵、尸溫等尸體現象的變化推斷死亡時間，但因其易受外界環境因素的影響，造成死亡時間的推斷誤差較大。 因此，尋找準確推斷死亡時間的方法對于法醫實踐中的應用至關重要。

近年來，利用RNA 的降解程度來推斷死亡時間已逐漸成為法醫學研究熱點。 LI W 等發現在大鼠的心肌組織中，線性RNA 在死后的96 h 內呈現平穩增高的趨勢，適合用于PMI 推斷。 但是國內學者呂葉輝等研究發現大鼠心肌內多種線性RNA 的表達受死亡原因的影響，且RNA 易降解，增加了其提取和檢測的困難，并不適合進行推廣應用。

環狀 RNA（circular RNA，circRNA）是一類以共價鍵形成的閉合環狀結構的非編碼RNA 分子，不具有5' 端帽子結構和3' 端poly A 尾。 RNase R 可以識別線性RNA 游離的3' 端，從而對其進行降解，而circRNA 由于其環狀結構，并不能被RNase R 所識別，故與傳統線性RNA 相比，其具有更高的穩定性。 本實驗利用其穩定性這一特點，以期篩選出與死亡時間具有相關性的circRNA，用于法醫實踐中對死亡時間的推斷。

1 材料與方法

1.1 樣本

從濟寧市公安局和濟寧醫學院司法鑒定中心收集18 例死亡時間在24 h 以內的個體并提取其肋間肌。 選入標準：（1）死亡時間在 24 h 以內，直至尸體被剖驗時為常溫保存；（2）排除遺傳性疾病及其他免疫性疾病和惡性腫瘤，以防影響circRNA 表達量檢測的準確性；（3）尸體均為交通意外或刑事案件受傷后死亡，取材部位無損傷（表1）。 每例均詳細記錄其死亡時間、死因、年齡、性別等資料。 然后放置在人工氣候箱內，模擬外界環境（溫度18 ℃，濕度60%），首先從濟寧市公安局的刑事案件中心收集芯片實驗選取2 例，皆因外傷死亡，已知死亡時間在 24 h 以內，分別于尸檢即刻（12 h 以內）、3、5、7、10 d 各取 50 g 肋間肌進行實驗，用于制作circRNA 表達譜。 后期收集的18 例分別在尸檢即刻（12 h 以內）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d 等時間點定點取樣，并立即置于液氮中凍存，最后統一進行總RNA 提取，并進行后續實驗。 收集到的上述樣本經濟寧醫學院倫理委員會審查批準， 且符合相關規定。

表1 樣本個體詳細信息表

續表1

1.2 方法

1.2.1 基因芯片實驗

本實驗由上海康成生物有限公司協作完成，主要實驗步驟包括：

（1）樣本 RNA 抽提：采用 Tri20L 進行 RNA 提取（invitrogen）；（2）RNA 質量檢測：測 OD 值計算濃度并評估純度（OD260/280 在 1.8～2.0 之間），瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 純度及完整性；（完整性比較好的總RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖呈現3 條帶，且3 條帶清晰無嚴重拖尾）；（3）使用 RNase R（Ribonuclease R，核糖核酸外切酶）（吉賽生物，R0301）消化線性RNA 分子；（4）使用逆轉錄試劑將去除線性 RNA 的RNA 反轉錄為帶有T7prometer 的 cDNA 序列，然后再將cDNA 轉錄成帶有熒光標記的 cRNA 序列；（5）標記效率質量檢測：使用Nanodrop 檢測熒光標記效率；（6）芯片雜交：在標準條件下將標記好的探針和高密度基因組芯片進行雜交；（7）圖像采集和數據分析：使用GenePix 4000B 芯片掃描儀掃描芯片的熒光強度，并將實驗結果轉換成數據型數據保存。

1.2.2 具有顯著差異表達的circRNAs 的篩選

采用 P 值小于 0.05（P＜0.05）、差異表達倍數絕對值大于等于2（|logFoldChange|≥2）篩選出具有顯著差異的circRNA； 將差異circRNA 進行STEM 分析，進一步篩選出整體為下降趨勢的circRNA； 將上述篩選的circRNA 進行熱圖分析，最終篩選出隨死亡時間的增加，相對表達量具有顯著差異的circRNAs。

1.2.3 引物設計

通過 cirbase 數據庫（http://www.circbase.org/）獲得circRNA 的序列，若序列太長則取首尾各150 bp進行拼接，末尾150 bp 作為拼接后的首序列，將該300 bp 序列用primer-blast 進行引物設計，具體參數根據引物設計原則進行設置，然后選擇引物（circRNA PCR 產物必須包含首位拼接位點）。若有已報道circRNA 引物，則采用文獻中引物。

1.2.4 內參基因選擇

在樣品處理過程中，RNA 水平的輕微變化都可以導致靶基因相對表達量的趨勢改變，而降解組織中又不存在合適且穩定的參考基因。 大量數據表明miRNA 在死后組織中較為穩定，進一步研究發現mir-133a 作為參考標志物為最佳。 因此，本研究對常用 GAPDH、β-Actin、mir133a-3p 的穩定性進行研究，以篩選出最佳參考基因。

1.2.5 實時熒光定量RCR

本研究中Ct 值范圍在15～35 之間，每個樣本做 3 個復孔，復孔間 Ct 值 STD＜0.2。

（1）取備檢組織樣本采用 trizol（Invitrogen 公司）法提取總RNA，按說明書操作。 然后進行電泳檢測其降解程度。 用NanoDrop2000c 紫外可見分光光度計檢測其純度及濃度。 采用mRNA 反轉錄試劑盒（TAKARA 公司），將 RNA 反轉錄為 cDNA 第一鏈，然后放置在-80℃下備用。（2）將上述的cDNA 樣本，應用 TB Green Premix Ex Taq II （TAKARA 公司），在QuantStudio 7 Flex 實時熒光定量PCR 儀系統上進行檢測，反應總體系20μL；反應程序參數：預變性 95 ℃ 30 s 后，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s 共 40 個循環。溶解曲線步驟：95 ℃ 5 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；冷卻溫度 50 ℃ 30 s。

1.3 統計分析

以△Ct 等于目的基因的CT 值減去內參基因的CT 值，△△Ct 為不同死亡時間的△Ct 減去死亡當天（12 h 以內）的△Ct 所得，以 2代表目標circRNA 在不同時間點相對死亡當天（12 h 以內）的差異表達倍數。 應用SPSS13.0 軟件進行統計學處理，實驗結果以x±s 進行描述。 兩個時間點之間的結果進行比較，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 芯片實驗結果

火山圖（圖 1）由 log（FC）及-lg（P 值）所組成，水平線代表P 值，垂直線代表相對表達量上調或下調2 倍。圖中的紅點代表具有顯著差異的circRNAs。將第3、5、7、10d 的結果與死亡當天（12h 以內）相比，第 3 天具有差異表達的circRNAs 數目最多。

圖1 火山圖

2.2 基因芯片篩選結果

STEM 分析結果發現部分circRNAs 相對表達量表現為先上升、后下降的趨勢（圖2），部分circRNA 則一直呈下降趨勢（圖3）。

圖2 芯片結果中具有隨死亡時間的進行，其相對表達量先升高再降低的基因簇

圖3 芯片結果中具有隨死亡時間的進行，其相對表達量降低的基因簇

2.3 熱圖聚類分析

熱圖分析結果顯示為四個部分：熱圖、橫軸和縱軸、色鍵。 橫軸為樣本，縱軸為基因名稱，熱圖中每一個小格代表一個基因，顏色則表示為該基因的表達量。 色鍵即用于查看基因表達量的對比鍵，紅色代表高表達量，綠色代表低表達量。 實驗結果展示了表達量具有顯著差異的circRNAs（圖4）。

圖4 具有差異表達的circRNA 聚類圖

2.4 差異表達基因的篩選

對熱圖分析篩選出的具有相同變化趨勢的circRNAs 進行進一步分析，隨死亡時間推移，在10 d內整體呈下降趨勢的circRNAs 有hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727、hsa_circ_000 5251、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0001946、hsa_circ_0001971 7 個，具體信息如表2。

表2 隨死亡時間表達下調的circRNAs

2.5 結果

2.5.1 引物序列信息

根據設計及查找所得序列如表3。

表3 引物序列

2.5.2 瓊脂糖凝膠電泳結果

根據引物序列進行PCR 實驗后，電泳結果顯示每對引物特異性良好，均表現出單一條帶，且無二聚體產生，引物可用于后續實驗（圖5）。

圖5 電泳圖

2.6 內參基因的選擇

根據NormFinder 軟件篩選，結果發現mir133a-3p 為在骨骼肌中最穩定的內參基因（n=18，mir133a-3p vs GAPDH、mir133a-3p vs β-Actin，***P0.001）（圖 6）。

圖6 不同內參基因穩定性分析結果

2.7 各目的基因的相對表達量隨死亡時間的變化

根據所篩選基因進行Q-PCR 實驗， 結果發現與死亡當天（12 h 以內）相比，在10 d 內整體呈下降趨勢的基因有5 個，分別為hsa_circ_0000284、hsa_circ_000 5251、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871（n =18，* P＜ 0.05，**P＜ 0.01，***P＜ 0.001）（圖7）。

圖7 各目的基因的相對表達量隨死亡時間的變化

3 討論

因circRNA 具有組織特異性及高度穩定性，目前在腫瘤、衰老、炎癥等方面研究較多，成為當今研究的熱點。 MENCZAK 等研究證實 circRNA 具有一定的組織、時序和疾病特異性，且對RNase R 具有較強的耐受性，不易受其降解。 FU 等研究發現hsa_circ_0005986 可以與 miR-129-5p 結合，起到miR-129-5p 海綿作用，從而抑制肝癌的發生，成為肝癌新的生物標志物。DU 等發現circ-Foxo3 可通過抑制蛋白的抗衰老作用，使心肌細胞快速衰老。

circRNA 雖在多個領域的研究獲得突破，但其在法醫學方面進行應用研究的報道極為少見，尤其是利用其結構穩定性、序列保守性及細胞或組織特異性表達等進行的相關研究。 趙禾苗等根據circRNA 表達的組織特異性，選取了兩個circRNAs 進行實驗，發現其在唾液、陰道分泌物、精液中廣泛存在，但具體的組織特異性circRNA 分子，仍在進一步的探索中。 死亡時間推斷一直以來是法醫學研究的熱點及難點。 截至目前，雖已有多種死亡時間的推斷方法，但均易受外界環境因素的影響，導致推斷結果出現較大誤差，嚴重影響案件的開展。 故此，法醫實踐工作中急需尋找一種準確推斷死亡時間的方法。 本研究利用circRNA 的結構穩定性、序列保守性及細胞或組織特異性表達等特點，查找表達量高，穩定性強，表達量與死亡時間的變化呈一定規律的circRNA，為在法醫實踐中準確推斷死亡時間提供重要的參考依據。

肌肉組織是人體中最豐富的組織，在被皮膚較好保護的同時又容易提取。與內臟和神經組織相比，骨骼肌在死后變化方面有較大的延遲，但其分解速度仍比軟骨和骨骼要快。 因此，肌肉組織宜于在法醫實驗室進行常規分析，是推斷中晚期死亡時間的一個常見候選組織。 本研究選用了分布范圍較廣，有肋骨保護，且與機體內外充分接觸的肋間肌作為研究對象進行死亡時間推斷研究。 結果表明肌肉組織可用于中晚期死亡時間推斷研究。

本實驗應用了實時熒光定量PCR 技術檢測circRNA 含量，因其靈敏度高、設備使用范圍廣、分析方法商業化等優點被認為是檢測RNA 的一種良好方法。此外，實時熒光定量PCR 結果的準確性很大程度上取決于內參指標的標準化，選取穩定的內參指標可以排除個體差異帶來的誤差，使統計結果更加客觀、準確。 對于人體樣本，找到合適的內參指標用于RNA 表達水平的準確定量至關重要。

已有報道稱在小鼠骨骼肌組織中miR-133a 和circAFF1 較為穩定。通過查找小鼠mir-133a 序列，發現人miR-133a-3p 為其同源序列。 通過研究發現在降解的肌肉組織中，miR133a-3p 與常用的GAPDH、β-Action 相比，較為穩定，適合作為該類實驗內參基因。

基因芯片技術作為一種先進的、大規模、高通量檢測技術，具有以下幾個方面的特點：一是高度的靈敏性和準確性；二是快速簡便；三是可同時檢測多種基因。 每一個circRNA 對應一個剪接點探針，能準確可靠地檢測單一circRNA，即便在對應線性RNA 存在的情況下也具有高特異性。circRNA 芯片目前涵蓋了人和小鼠的circRNA 位點。 本研究通過circRNA 芯片篩選得到了較多的circRNA，更有利于對circRNA 差異表達譜進行全面、準確的分析。 通過篩選最終發現hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727 等 7 個與死亡時間具有負相關性的circRNAs。但在后續的驗證實驗中發現只有其中五個circRNAs 相對表達量隨死亡時間變化具有顯著差異，分別為hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0001871，但hsa_circ_0001871 表現為先上升后下降的趨勢，提示只有部分的circRNA 降解具有穩定的規律性變化，可根據其降解速度進行死亡時間的推斷。

目前，circRNAs 相對表達量上升或下降的機理并不明確。 在正常生理情況下， JECK 等將circRNA的形成機制總結為“套索驅動環化”模型，及“內含子配對驅動環化”模型，circRNA 來源于外顯子跳躍（exonskipping）事件，其會產生一個包含外顯子的套索結構（exon-containing lariat），然后再經過內部拼接成一個由外顯子組成的circRNA。由此可見，任何外顯子跳躍事件都具有形成circRNA 的潛能，同時長側翼（long flanking introns）及豐富的ALU 重復序列都會增加其環化的能力。 LASDA 等研究認為，circRNA 的降解機制或許和胞外囊泡共沉淀有關，circRNA 通過囊泡作用運輸到胞外，然后胞外囊泡被其他細胞吸收，從而使得circRNA 被降解。 但也有研究發現，作為RNA 編輯因子（RNA-editing factor）的ADAR1 對有外顯子環化來源的 circRNA 具有抑制作用，敲除其所在位置的基因發現，部分circRNA 的表達量有所上升。 部分 circRNA 也可作為內源競爭性RNA 在體內被小干擾RNA（Small interfering RNA;siRNA）所降解。 最新的研究表明m6A 可以識別蛋白 YTHDF2 結合靶分子，募集HRSP12，進而介導RNA 內切核酸酶RNase P/MRP復合物切割靶分子，而這一過程可以作用于mRNA和 circRNA。 由此可見，對于 circRNA 的降解機制，目前仍沒有統一明確的解釋，仍需進一步研究探討。

本實驗中也同時發現，部分circRNA 分子表達量的變化與死亡時間無相關性，如hsa_circ_ 0001946、hsa_circ_0001971，考慮或許是其受外界其他環境因素的影響所致，后續將繼續增加樣本數量，設置更多變量，尋找更加穩定的circRNA 分子，以建立更加科學的數學模型，達到準確推斷死亡時間的最終目的，從而為死亡時間的推斷開辟一條新的路徑。

本實驗篩選出了5 個隨死亡時間延長呈穩定下降趨勢的circRNAs，可用于死亡時間的推斷研究。 circRNA 的穩定性使其在陳舊、腐敗降解檢材的檢測中具有巨大優勢，可以作為新興的法醫鑒定分子標記使用。