亞硝酸鹽降解芽孢桿菌的篩選鑒定及其降解效果研究

楊 程 徐 萍 文 芳 田丹丹 孫澤平

（黔南民族師范學院生物科學與農學院，貴州 都勻 558000）

0 引言

近些年，魚類養殖等行業面臨養殖水體的水質劣化、養殖物容易發生病害等問題，嚴重影響了行業的發展，并產生水體污染等問題。 利用一些具備特殊降解能力的微生物來降解水產養殖產生的污染物，凈化水體，穩定水質是一種可行的解決辦法[1，2]。 在實際生產中，很多微生物可以通過單一或復合制劑的形式應用在水產養殖過程中，從而對水質、底質問題有所改良。 其中，芽孢桿菌不僅具有一般微生態制劑的特性，還具有一系列的自身優勢，例如，抗逆性強，穩定性高等，因此已經用于水產業中。 根據芽孢桿菌的生理特點以及在養殖過程中嚴格的要求，它在水產行業及水體生態治理方面具有較好的應用前景，值得深入挖掘其潛能[3-6]。

本研究從都勻市雨花湖底泥樣品中用熱處理和富集培養分離出芽孢桿菌，再通過試驗指標篩選出降解NO2-有明顯效果的菌株，并對篩選的菌株進行了鑒定。 實驗證明篩選出的芽孢桿菌能有效降低水體中的NO2-含量，凈化水質。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

從貴州省都勻市雨花湖公園附近，5～15 cm 深土層的土壤和不同水域的泥底中各取樣10 個。 試驗用的泥鰍購于江蘇省連云港市贛榆區大學生生態漁場養殖基地。

1.2 試劑及儀器

用到的試劑主要有香柏油、KNO3、NaNO2、（NH4）2SO4、芽孢染色液（廣東環凱029020）、瓊脂粉、二甲苯、革蘭氏染色液、蛋白胨。 設備主要有：恒溫搖床、分光光度計、高壓滅菌鍋和超凈臺等。

1.3 模擬水樣及培養基

模擬水樣：LB 培養基稀釋6.5 或60 倍備用。富集培養基：硝酸鉀0.5 g，亞硝酸鈉0.5 g，硫酸銨 1 g，葡萄糖2.5 g，泥鰍缸廢水500 mL。 篩選培養基：硝酸鉀1.5 mg，亞硝酸鈉 3.75 mg，硫酸銨 3.125 mg，葡萄糖0.5 g，泥鰍缸廢水500 mL。

1.4 產芽孢菌株的篩選和分離

在富集培養基中按照樣品和培養基1∶5 接種樣品，然后恒溫培養24 小時左右。 將所得菌懸液放在預熱好的80 ℃水浴中保溫25 分鐘后取出， 再用搖床120 r/min，30 ℃震蕩培養約12 小時，將處理過的菌懸液按10-2、10-3的濃度梯度涂布在LB 固體培養基上，30℃靜置培養20～36 小時。 待長出菌落后，挑選單個菌落進一步進行純化，采用斜面傳代保藏法和甘油冷凍法保存以待備用。

1.5 篩選具有降亞硝酸鹽特性的菌株

純培養得到的產芽孢菌用LB 液體培養基活化后稀釋，取稀釋后的菌液涂布在篩選培養基上，30℃培養24 小時后觀察菌落，挑取其中最大的幾個菌落，純培養后保藏，以備后續實驗。 所得菌株重復上述過程進行復篩。 最終得到一株降解亞硝酸鹽效果明顯的菌株，命名為Y2。

1.6 菌種鑒定

分離、 篩選得到的菌Y2 通過采用涂布平板的方法進行接種，30℃培養至長出菌落后， 觀察菌落的形狀、大小、顏色等特征且用常規的染色方法及革蘭氏染色法、芽孢染色法進一步觀察菌體的形態特征。 菌株進行 16S rDNA 測序（上海生工），通過 NCBI 網站中的 Blast 程序進行同源性比對，用MEGA-X 軟件進行同源排列，構建系統進化樹，推測Y2 的同源關系。

1.7 Y2 菌對模擬水樣及泥鰍養殖水中亞硝酸鹽的降解作用

稀釋模擬水樣6.5 倍后取樣測定初始OD 值，28℃靜置處理，設置2 個平行組和1 個空白對照，平行試驗組每個三角瓶都投入濃度約為4.0×106cfu/mL 的等量菌液且每相隔48 小時取樣測3 個模擬水樣OD 值，用分光光度法根據亞硝酸鹽國標檢測標準測得出平行組與空白組中亞硝酸鹽的含量， 實驗組結果取2 個平行組的平均值[8]。 購回的泥鰍置于魚缸中養殖大約一個星期，挑選大小及活躍度相近的45 條，隨機平均分配在3個相同的魚缸內，魚缸內初始的水體相同。實驗組中加入濃度約為3.0×106cfu/ml 的Y2 菌液，每日固定時間投喂等量的食物一次，每隔48 h 取樣測3 個模擬水樣OD 值，采樣前的24 h 停止喂食，用分光光度法根據亞硝酸鹽國標檢測平行組與空白組亞硝酸鹽的含量，實驗組結果取2 個平行組的平均值。

2 實驗結果

2.1 菌株分離、篩選與鑒定

將樣品經過富集和熱處理以后接種于固體平板，得到單菌落若干，挑選其中五株較大的單菌落培養保藏。 將這五株菌活化后進行初篩和復篩，最后獲得生長速度較快，菌落較大的菌株一株，命名為Y2，將Y2菌株進一步確定為研究對象。 肉眼觀察Y2 菌落為米黃色，菌落表面較光滑，如圖1A。對Y2 芽孢染色，染色結果顯示Y2 菌呈桿狀，具有芽孢結構，其芽孢為橢圓且為中生，如圖1B。對Y2 進行革蘭氏染色顯示Y2為革蘭氏陽性菌。 對Y2 進行16S rDNA 測序并構建系統進化樹分析，結果如圖1D 所示。 由進化樹可知，Y2 菌株和阿耶波多氏芽孢桿菌 （Bacillus aryabhattai B8W22） 的親緣關系最近。 結合形態學的鑒定和16S rDNA 的分析結果可以基本確定出Y2 為阿耶波多氏芽孢桿菌。

圖1

2.2 Y2 菌株對亞硝酸鹽的降解

將Y2 菌株按一定濃度稀釋后分別加入模擬水樣和泥鰍養殖水樣中， 測定Y2 對兩類水體中亞硝酸鹽的降解效果。 首先在模擬水樣中亞硝酸鹽濃度的測定結果如圖2A 所示。在實驗組加入4.0×106cfu/mL 濃度的Y2 菌液，實驗組NO2-含量變化呈明顯的下降，NO2-去除率為63.58%；作為對照的未加入Y2 組中NO2-含量則呈上升的趨勢，上升率為17.35%；這一結果表面在模擬水樣中加入Y2（Bacillus aryabhattai）可以有效地降低模擬水樣中NO2-含量。 在泥鰍養殖水體中亞硝酸鹽濃度變化結果如圖2B 所示。 實驗組中加入了濃度約為 3.0×106cfu/mL 的 Y2 菌液，NO2-含量在實驗組中也有下降，NO2-去除率為24.3%； 而未加入Y2 的對照組中NO2-含量略微有上升趨勢，上升率3.6%。 這一結果表明泥鰍養殖污水中加入Y2 菌后也可有效降低水中NO2-含量。

圖2 模擬水樣以及泥鰍養殖水樣中NO2-含量隨時間的變化

3 討論與展望

本研究以人工湖泊和土壤為樣品源，以其對亞硝酸鹽的降解能力為主要參考指標篩選出1 株芽孢桿菌Y2，并根據其形態特征和分子鑒定，該菌被鑒定為阿氏芽孢桿菌。 通過對Y2 菌株在模擬水樣及泥鰍養殖水體中亞硝酸鹽含量的影響研究， 證明Y2 菌株可以有效的降低水體中亞硝酸鹽的含量。

水體中NO2-濃度太高會對水體中的一些生物造成危害，對于水產養殖有較大的危害。 本研究分離的阿氏芽孢桿菌Y2 菌株在實驗中顯示出較好的亞硝酸鹽去除效果，從而改善水質，因此本研究所分離的Y2菌株在凈化水體，改善水產養殖水體水質方面具有一定的應用潛力和價值。 另外阿氏芽孢桿菌作為一種芽孢桿菌，生長條件要求不高、抗逆性極強，十分便于大規模的培養和應用在微生物制劑中。 很多研究表明，微生物制劑不僅能夠有效地降低水產養殖過程中有害物質的很多不利影響，而且能有效改善水質[6，7]。 可以用來在水產養殖中應用益生菌改善養殖水體的質量、提高養殖物的生長力和免疫能力[8]。 在未來進一步的研究中可以深入研究Y2 菌株的這一潛力。