早春栽培的印度南瓜果實淀粉積累相關酶的活力

馬 瑋，張 蒙，史玉滋，疏 琴，孫廷珍，薄凱亮，王福利，段 穎，王長林

（1. 農業農村部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室·中國農業科學院蔬菜花卉研究所 北京 100081；2. 北京市農業技術推廣站 北京 100029）

印度南瓜（）原產于南美洲，是葫蘆科南瓜屬主要栽培種之一，在我國廣泛栽培。印度南瓜果肉是主要食用部位，其肉質軟糯，口感甜面，富含碳水化合物、類胡蘿卜素、維生素、南瓜多糖等多種營養和保健功能成分，其產業前景日益受到關注。

淀粉是1，4-糖苷鍵組成的葡聚糖，主要分為直鏈淀粉與支鏈淀粉兩種。淀粉合成在葉綠體或淀粉體中進行，由一系列酶催化完成，主要涉及五類關鍵酶，分別為ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophsphorylase，APGase）、顆粒型淀粉合成酶（granule-bound srarch synthase，GBSS）、可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase，SSS）、淀粉分支酶（starch branching enzymes，SBE）及淀粉去分支酶（debranching enzymes，DBE）。目前利用基因組或轉錄組測序，已經分別從美洲南瓜（）和中國南瓜（）鑒定到40 多個與淀粉代謝調控相關編碼基因。在印度南瓜中的研究表明，淀粉代謝調控相關編碼基因的轉錄模式在高淀粉種質和低淀粉種質中類似，但、、、、、和等基因表達水平差異顯著，推測南瓜果實淀粉積累與淀粉合成前體限速酶APGase、顆粒型淀粉合成酶關鍵酶GBSS、可溶性淀粉合成關鍵酶SSS 以及淀粉分支酶SBE 密切相關，而淀粉去分支酶DBE 的主要作用是將不正確的α-1,6-糖苷鍵分支進行水解，其是否參與淀粉降解還有待進一步研究。利用轉錄組測序對不同淀粉含量的中國南瓜果實淀粉代謝調控相關基因進行分析，發現、和是不同南瓜果實淀粉積累差異的關鍵基因。

印度南瓜果肉淀粉組分和含量是重要果實品質性狀之一，淀粉含量與果實口感品質密切相關。對印度南瓜研究的結果表明，低淀粉含量品種的果肉質地疏松粗糙，口感生澀，而高淀粉含量品種的果肉質地致密細膩、甜面，其直鏈淀粉和支鏈淀粉含量均顯著高于低淀粉含量種質。然而目前在印度南瓜品種選育的實際應用中，通常以口感作為果實品質性狀鑒定的手段，容易受到評價者的經驗、果實成熟狀態等影響，一定程度上影響了鑒定準確性。

不同栽培方式對南瓜果實淀粉含量存在較為明顯的影響。目前，對中國南瓜的研究表明，與露地栽培相比，日光溫室栽培模式下的中國南瓜在果實品質和產量等方面均有較大提高，并且采收期明顯提前。在我國北方地區，露地栽培方式生產的南瓜，在生長前期容易受到低溫冷害，生長后期容易因高溫感染病毒病導致果實畸形，往往對產量造成嚴重影響。隨著人們對印度南瓜消費需求的提升，篩選適宜保護地早春茬口栽培的優質品種越來越受到重視。研究早春日光溫室栽培條件下果實淀粉合成及相關酶代謝規律，明確影響果實淀粉積累的關鍵生理指標，對于篩選創制南瓜優異種質具有重要意義。筆者在本試驗中在早春茬日光溫室栽培條件下，利用Agol、雪2 父2 份低淀粉含量種質和S8844、無名綠2 份高淀粉含量種質，研究淀粉代謝相關酶活力對果實淀粉積累的影響，以期為篩選鑒定適宜早春茬口保護地栽培印度南瓜的優異種質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用4 份印度南瓜自交系Agol、雪2 父、S8844、無名綠，均為中國農業科學院蔬菜花卉研究所南瓜課題組培育8 代以上的高代自交系。其中，雪2 父、S8844、無名綠為蔓生種質，單株結瓜數2～4個，Agol 為短蔓種質，單株結瓜數4～6 個。S8844、無名綠果實口感甜面，果肉淀粉含量和可溶性固形物含量高。Agol、雪2 父果實口感較苦，果肉淀粉和可溶性固形物含量較低。

1.2 試驗設計

試驗于2018 年3—7 月在中國農業科學院蔬菜花卉研究所河北廊坊試驗基地進行。2018 年3月15 日選取籽粒光滑飽滿的南瓜種子，28 ℃生長箱內催芽2 d 后，播種至32 孔穴盤育苗，當幼苗長至2 葉1 心時，定植于日光溫室內，溫室長100 m，高3.5 m，畦長6.5 m，行距1.3 m，株距0.5 m。光量子通量密度（PFD）為410 μmol·m·s，最高氣溫33.5 ℃，最低氣溫8.2 ℃，晝夜平均氣溫21.1 ℃，最高濕度89.5%，最低濕度19.4%，晝夜平均濕度為51.77%。5 月1 日進行人工授粉，雌花經人工授粉后于14、21、28、35、42 d 對生長一致的果實進行采收，并對相關指標進行測定。按照采收日期，分別將3 枚果實的去籽果肉切塊凍于液氮中，待全部果實采收完畢，進行淀粉代謝相關酶活力檢測。

1.3 果實質量和干物質含量測定

南瓜鮮果實質量采用電子天平進行測定。果肉去除果皮和籽粒后，稱取100 g 鮮果肉（），切成薄片，在65 ℃恒溫干燥箱內烘干48 h，取出后進行稱質量（），果肉干物質含量測定公式為（/）×100%。

1.4 淀粉含量測定

稱取約10.0 g 南瓜烘干果肉，采用研磨儀進行充分研磨，設定參數為60 Hz，60 s/次，共進行3 次研磨，獲得果肉烘干粉末。南瓜果肉淀粉提取方法參照Stevenson 等方法進行提取，稱取2 g 果肉烘干粉末，加入0.05% NaOH 溶液充分震蕩24 h，12 000 r·min離心10 min 后加入蒸餾水進行清洗2 次，沉淀轉移至50 mL 離心管，5000 r·min離心10 min 后棄上清，沉淀加入9 mL 0.1 mol·LNaCl和100 μL 10%甲苯進行脫脂清洗，加入蒸餾水進行2 次清洗，再加入無水乙醇進行2 次清洗后，轉移至Whatman No 4 濾紙上，35 ℃烘干，獲得淀粉粗提樣品。

南瓜果肉直鏈淀粉和直鏈淀粉測定方法參照范明順等方法進行并略作修改。稱取25 mg 淀粉粗提樣品置于25 mL 容量瓶中，加入250 μL 95%乙醇，1 mol·LNaOH 2.25 mL，30 ℃恒溫箱內糊化24 h，加熱至95 ℃振蕩保溫8 min。待淀粉完全溶解后，冷卻至室溫，定容至25 mL。將一定濃度的稀釋液轉移至新的容量瓶中，加入1 mol·L乙酸250 μL，500 μL 碘比色液，定容至2 mL。采用分光光度法分別于620 nm 波長下測定直鏈淀粉含量，于535 nm 和730 nm 波長下測定支鏈淀粉含量。以馬鈴薯直鏈淀粉和支鏈淀粉配制成1.0 mg·mL溶液，按照如下體積比例混合配制標準溶液：直鏈淀粉0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 μL；支鏈淀粉4.75、4.5、4.0、3.5、3.0 μL。將標準溶液加入碘比色液，并稀釋至25 mL，在620 nm、535 nm、730 nm 波長下測定吸光值。直鏈淀粉和直鏈淀粉的含量以相關標準曲線進行計算。直鏈淀粉標準曲線為：=1.482 4+0.007 7（=0.995 4），支鏈淀粉標準曲線為：=-0.232 5+0.217 6（=0.996 5）。

1.5 淀粉相關酶活測定

參照Nakamura（1989）方法進行并略作修改。

1.6 數據統計分析方法

采用Microsoft Excel 2010 進行數據統計，SPSS 23.0 對數據進行單因素方差分析，并運用Duncan’s 檢驗法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 印度南瓜果實不同發育時期生長指標

對Agol、雪2 父、S8844 和無名綠不同發育時期的單瓜鮮質量和干物質含量進行測定（表1）。雪2 父單瓜鮮質量在授粉后14 d 增長幅度最大，是其他種質的1.6～1.8 倍。在果實生長中期（28～35 d），Agol 和S8844、無名綠單瓜鮮質量較發育初期均有較大幅度增長，至果實成熟期（42 d）Agol 和S8844的單瓜鮮質量均接近雪2 父，約為1.30 kg 和1.48 kg。無名綠單瓜鮮質量在4 份種質中最低，至果實成熟期僅為1.13 kg，約為其他種質的66%～87%。

表1 印度南瓜果實不同發育時期單瓜鮮質量和干物質含量

對果實干物質含量進行測定，在授粉后14 d，S8844 干物質含量（，后同）達到12.6%，而其他種質為5.1%～8.4%。隨著果實的發育，無名綠干物質含量迅速增加，與S8844 較為接近。至果實成熟期（42 d），S8844 和無名綠的干物質含量均顯著高于Agol 和雪2 父，干物質含量分別為26.1%和33.0%，而Agol 和雪2 父僅為11.8%和8.0%。

2.2 印度南瓜果實不同發育時期淀粉含量

采用紫外分光光度法分別對Agol、雪2 父、S8844 和無名綠果實不同發育時期的直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量進行測定（圖1）。4 份種質的總淀粉含量在果實發育過程中總體呈增加趨勢，2份高淀粉含量種質和2 份低淀粉含量種質在總淀粉含量和支鏈淀粉含量上差異較大：S8844 和無名綠的成熟果實總淀粉含量為85%～88%（干質量，后同），而Agol 和雪2 父約為40%。從積累模式上看，隨著果實發育成熟，Agol 和雪2 父支鏈淀粉變化趨勢一直較為穩定，而S8844 的支鏈淀粉在果實生長前期（14～28 d）已經進入快速積累期，無名綠的支鏈淀粉在果實生長前期積累較不明顯，而在后期（35～42 d）增幅最為明顯，至授粉后42 d 時，無名綠支鏈淀粉含量已經達到Agol 和雪2 父的1.6～1.9 倍。4 份種質果實直鏈淀粉含量均一直維持較低水平，且在整個果實發育過程中變化趨勢不明顯，S8844 和無名綠的直鏈淀粉含量略高于Agol 和雪2 父。至果實成熟時，4 份種質果實直鏈淀粉含量分別占總淀粉含量的12.4%、14.7%、11.9%、10.8%。

圖1 4 種印度南瓜果實不同發育時期直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量

2.3 印度南瓜果實不同發育時期淀粉合成酶活力

為明確印度南瓜果實發育過程中淀粉積累相關酶的酶活力變化趨勢，對4 份種質在不同發育階段的ADP 焦磷酸化酶（AGPase）、可溶性淀粉合酶（SSS）、顆粒結合型淀粉合酶（GBSS）和淀粉分支酶（SBE）進行酶活力測定。如圖2-A，AGPase 酶活力測定結果顯示，2 個低淀粉種質Agol 和雪2 父的AGPase 酶活力在整個果實發育時期都較低，且隨果實發育進一步降低；2 個高淀粉種質S8844 和無名綠的AGPase 酶活力在果實發育中期（28 d）開始增加，至果實發育后期（35 d）達到峰值，隨后逐漸降低（圖2-A）。

圖2 印度南瓜果實不同發育時期淀粉合成相關酶活力

圖2-B 顯示GBSS 酶活力測定結果。在4 份種質的果實發育過程中。GBSS 酶活力均表現為先上升再下降的趨勢。其中，雪2 父和S8844 的GBSS酶活力在果實發育早期較高，為Agol 和無名綠的1.6～4.0 倍。而在果實發育后期，雪2 父和無名綠的GBSS 酶活力仍維持較高水平，隨后至果實成熟時，4份種質的酶活力均降至最低水平（圖2-B）。

圖2-C 顯示SSS 酶活力測定結果。在4 份種質的果實發育早期，SSS 酶活力均處于上升趨勢。在2 份低淀粉種質Agol 和雪2 父中，SSS 酶活力峰值出現于授粉后28 d，而高淀粉種質S8844 的SSS酶活力峰值出現于35 d，無名綠的SSS 酶活力峰值則在果實成熟時出現。在果實發育后期（35～42 d），Agol、雪2 父和S8844 的酶活力明顯降低，而無名綠仍維持較高水平。至果實成熟時，無名綠SSS 酶活力是其他3 份種質的5.2～6.4 倍（圖2-C）。

對不同發育階段的果實SBE 酶活力進行測定，發現無名綠、S8844 明顯高于雪2 父、Agol，且隨著果實的成熟，SBE 酶活力在2 份高淀粉含量種質中呈逐漸降低趨勢，而SBE 酶活力在2 個低淀粉含量種質中則一直維持較低水平（圖2-D）。

2.4 印度南瓜果實不同發育時期淀粉分解酶活力

對印度南瓜果實不同發育時期淀粉分解途徑相關α-淀粉酶、β-淀粉酶和總淀粉酶活力進行測定。α-淀粉酶活力測定結果顯示，雪2 父在整個果實發育時期的酶活力一直較高，而其他3 份種質的酶活力隨果實發育成熟而逐漸降低（圖3-A）；β-淀粉酶活力測定結果顯示，Agol 和雪2 父的酶活力高于S8844 和無名綠。總淀粉酶活力隨果實發育的變化趨勢，與β-淀粉酶活力的變化趨勢較為接近（圖3-B）。

圖3 印度南瓜果實不同發育時期淀粉分解相關酶活力變化

2.5 印度南瓜果實不同發育時期淀粉含量與酶活力相關性分析

為明確日光溫室栽培條件下印度南瓜果實淀粉積累的重要影響因子及作用，對不同發育時期果實直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量與淀粉合成分解途徑相關酶的酶活力進行相關性分析（表2）。結果顯示，淀粉合成相關酶中，AGPase 酶活力在果實生長后期（35～42 d）與直鏈淀粉和支鏈淀粉含量相關系數較高，分別達到0.916、0.929、0.966 和0.988；GBSS 酶活力在授粉后28 d 時與淀粉含量呈負相關，相關系數較高，分別達到-0.970 和-0.937；淀粉分支酶SBE 酶活力與淀粉含量在果實生長前期和中期的相關系數較高，分別達到0.979、0.999、0.989、0.974。而隨著果實的成熟，其相關性降低；SSS 酶活力與淀粉含量的相關性較低。淀粉分解相關酶中，β-淀粉酶在果實發育中期與淀粉含量呈負相關，相關系數為-0.989 和-0.981。

表2 印度南瓜果實不同發育時期淀粉含量與酶活力的相關性分析

3 討 論

在中國北方地區利用日光溫室栽培為早春茬印度南瓜生長提供適宜的晝夜溫度，對高淀粉類型印度南瓜果實淀粉積累、直鏈淀粉和支鏈淀粉比例調控及果實品質改良有積極意義。淀粉含量是影響印度南瓜品質和口感的重要因素。由于果實品質性狀形成較為復雜，因此育種中需要了解各因素之間的聯系，明確性狀調控關鍵因子，以期對育種材料進行高效篩選。目前，一些研究揭示了南瓜果實品質的遺傳調控機制，相關酶及其編碼基因的表達模式和功能研究也逐漸深入。本試驗在前人工作基礎上，進一步探討了冬春日光溫室栽培環境下，不同淀粉含量的印度南瓜果實淀粉積累規律及其與淀粉代謝相關酶活力的相關性，挖掘影響果實淀粉積累的關鍵因子。

3.1 栽培溫度對淀粉合成酶活力的影響

在南瓜屬的研究中，Nakkanong 等利用中國南瓜和印度南瓜及種間雜交種，提出淀粉含量與淀粉合成酶編碼基因轉錄水平之間的關系。在擬南芥、小麥等模式作物的研究中表明，果實淀粉積累相關酶在轉錄和翻譯后水平受到溫度、晝夜節律等多種因素影響，其調控機制較為復雜。植物淀粉合成酶具有不同的溫度敏感性：小麥種子胚乳細胞SSS 酶活力適宜溫度在20～25 ℃之間，而水稻種子胚乳SSS 酶活力在29～35 ℃時較高，在22～28 ℃時較低，GBSS 和SBE 活力則正相反。因此，支鏈淀粉鏈的長度和比例受溫度影響較大。目前，晝夜溫度對不同淀粉積累類型的印度南瓜淀粉合成酶活力的影響尚不明確，值得進一步深入研究。筆者在本試驗中利用4 份淀粉含量不同的種質，初步研究了北方地區早春茬溫室栽培條件下的淀粉含量與淀粉合成酶活力之間的相關性。根據溫濕度記錄儀數據顯示平均晝夜溫度為21.1 ℃，在此條件下高淀粉含量種質中與淀粉合成有關的酶活力如APGase、SBE 均維持較高水平，與低淀粉含量種質差異明顯。在一些田間試驗中顯示，不同的栽培茬口對同一種印度南瓜果實口感、甜度和淀粉含量存在一定的影響。淀粉酶活力調控機制是否與溫度有關，有待進一步研究。

3.2 不同發育時期印度南瓜果實淀粉含量積累和酶活力動態變化趨勢

前人研究表明，南瓜果實淀粉含量與干物質、可溶性固形物、可溶性糖和多糖含量呈極顯著正相關。本試驗中，2 份低淀粉含量種質Agol、雪2父的干物質含量較低，推測可能與同化物合成速率水平較低，并且向果糖、蔗糖或其他碳水化合物等方向轉化有關。2 份高淀粉含量種質的淀粉積累方式也存在較為明顯的區別：S8844 在果實整個生長周期中，淀粉合成和積累速率都非常高，而無名綠則在果實特定的發育階段，淀粉合成和積累速率迅速升高（圖1-C～D）。

植物細胞淀粉主要在葉綠體和淀粉體中進行合成。APGase 將1-磷酸-葡萄糖和ATP 轉化為淀粉合成底物腺苷-2-磷酸葡萄糖（adenosine diphosphate glucose，ADPG），是淀粉合成途徑中的關鍵限速酶之一。目前，轉錄組測序結果顯示南瓜屬基因組至少有2 類ADPG 編碼基因，分別命名為和，而印度南瓜的基因轉錄水平與淀粉含量存在顯著相關性。在南瓜中的研究還表明，與中國南瓜蜜本、黃狼南瓜相比，印度南瓜紅香栗淀粉含量更高，其APGase 酶活力也在果實發育時期一直維持較高的水平，說明APGase 酶活力在果實不同發育時期淀粉積累中的重要作用。本試驗中也檢測到高淀粉種質S8844和無名綠的APGase 酶活力隨果實發育成熟而進一步升高（圖3-A）。對于擬南芥的研究表明，不同的APGase 單體可能在果實發育特定時期通過異源多聚體的聚合及構象變化，從而使淀粉與果糖合成效率維持動態平衡。這為印度南瓜APGase 酶活力受到轉錄調控和翻譯后的調控機制研究提供了一定的思路。

直鏈淀粉的形成主要受GBSS 催化調控，通過-1，4 糖苷鍵將ADPG 連接到糖鏈的非還原性末端，南瓜屬栽培種基因組中至少存在4 個GBSS家族基因。目前，在中國南瓜、印度南瓜中已經鑒定出多個GBSS 亞基的編碼基因，并發現其中一些基因的轉錄水平與淀粉含量密切相關。小麥種子直鏈淀粉/支鏈淀粉比例較高，基因組中存在多個GBSS 編碼基因，且mRNA 存在多種可變剪接，共同調控GBSS 酶活力。本試驗中，GBSS 酶活力與果實淀粉含量之間的相關性較低，僅在果實生長中期（28 d）呈負相關性（圖2-B），推測這是由于印度南瓜果實直鏈淀粉占果實總淀粉含量比例較小，其酶活力對總淀粉含量的影響并不顯著。

支鏈淀粉形成主要受SSS、SBE 等酶催化調控。SSS 通過α-1，4 糖苷鍵將ADPG 連接到糖鏈上形成可溶性淀粉，SBE 催化-1，6 葡萄糖苷加入到葡萄糖鏈的分支端以延伸支鏈淀粉鏈。植物中至少存在4 種不同的SSS 和2 種SBE。目前，在南瓜屬中至少鑒定到2 個SSS 和3 個SBE。已有研究報道中國南方地區日光溫室栽培的印度南瓜果實淀粉含量與和基因轉錄水平的相關性較低，本試驗顯示SBE 酶活力與淀粉含量相關性較高，推測基因在轉錄后和翻譯后受到了一定的調控和修飾，使其結構和功能發生改變，從而影響果實淀粉合成速率。這種翻譯后的修飾作用很可能受到種質自身遺傳特性及環境因子的共同影響。

淀粉分解過程主要由α-淀粉酶、β-淀粉酶和淀粉磷酸化酶催化。其中α-淀粉酶主要負責水解α-1，4 糖苷鍵，而β-淀粉酶主要水解α-1，6 糖苷鍵。研究表明印度南瓜果實淀粉含量快速增長期淀粉酶活力較低，而在果實成熟期和采后貯藏期淀粉酶活力迅速提升。本試驗中，β-淀粉酶和總淀粉酶活力在高淀粉種質中較低，而在低淀粉種質中較高，明確了淀粉水解酶在淀粉積累中的作用。

4 結 論

印度南瓜果實淀粉含量由淀粉合成、貯藏與分解代謝的動態平衡共同決定，其調控機制受到栽培環境影響較大。本研究結果表明早春茬日光溫室中栽培的印度南瓜，果實淀粉含量在幼果期與SBE酶活力呈正相關，在果實發育中后期與AGPase 酶活力呈正相關，與β-淀粉酶和總淀粉酶活力呈負相關。在進行高淀粉含量印度南瓜種質的篩選時，可將幼果期果實SBE 酶活力值作為果實淀粉積累潛力的參考生化指標之一。后續研究可以繼續關注印度南瓜雌花花冠和子房SBE 酶活力與成熟果實淀粉含量之間的相關性，以期進一步加快苗期篩選進程，減輕育種工作量。此外，晝夜溫度及晝夜節律對不同品種印度南瓜果實淀粉含量及酶活力調控機制也值得進一步研究。本試驗為高品質印度南瓜種質的早期篩選提供一定的參考依據。