參附注射液治療心肌缺血再灌注損傷網絡藥理學分析

孔智謙 莫夢瑩 陳達滿 黃海燕

〔摘要〕 目的 基于網絡藥理學研究預測參附注射液治療心肌缺血再灌注損傷的主要活性成分、作用靶標和相關信號通路，并應用體外實驗驗證，揭示參附注射液治療心肌缺血再灌注損傷潛在作用機制。方法 應用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺收集參附注射液的有效活性成分和靶點信息;在GeneCards疾病數據和DisGeNET疾病數據庫中收集缺血再灌注損傷疾病靶點;取藥物靶點與疾病靶點進行交集映射;運用STRING數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡，獲取核心靶標信息;運用R軟件進行GO分析和KEGG通路富集分析;最后運用體外實驗驗證參附注射液核心成分對對CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG作用靶點的調控作用。結果 預測發現參附注射液有效活性成分有9個，靶點有56個，有38個潛在作用靶點作用于缺血再灌注損傷的治療，包括CASP3、CASP8、IL-1β等;涉及IL-17、TNF、p53等信號通路;體外細胞實驗結果驗證參附注射液的有效活性成分可活化IL-17和TNF信號通路，下調相關靶標CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG的表達，抑制炎癥反應和細胞凋亡。結論 參附注射液有多成分、多靶點的優勢，其治療缺血再灌注損傷的作用機制可能為活化IL-17和TNF信號通路，為新藥開發和后續研究提供參考。

〔關鍵詞〕 心肌缺血再灌注損傷;參附注射液;網絡藥理學;β-谷甾醇;人參皂苷

〔中圖分類號〕R256.22 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.026

〔Abstract〕 Objective To predict the main active ingredients， action targets and related signaling pathways of Shenfu Injection in the treatment of myocardial ischemia reperfusion injury based on the network pharmacological research， and to explore the potential action mechanism of the Shenfu Injection for myocardial ischemia reperfusion injury through in vitro experimental verification. Methods The TCM system and pharmacological database and analysis platform was used to collect the effective active ingredients and targets information of the Shenfu Injection; ischemic reperfusion injury disease targets were collected in GeneCardsdisease database and DisGeNET disease database; intersection mapping of drug targets and disease targets was carried out; the protein-protein interaction network was constructed using the STRING database to obtain core targets information; R software was used for GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis; finally， in vitro experiments were used to verify the control effect of the core component of Shenfu Injection on the activation of CASP3， CASP8， AP-1， IL-1β， IFNG. Results It is predicted that there were 9 effective active ingredients of the Shenfu Injection， 56 targets and 38 potential targets acting on the treatment of ischemia reperfusion injury， including CASP3， CASP8， IL-1β， involving IL-17， TNF， p53 signaling pathways， etc. In vitro cell experimental results confirmed that the Shenfu Injection can activate IL-17 and TNF signaling pathways， reduce the expression of relevant targets CASP3， CASP8， AP-1， IL-1β， IFNG and inhibit inflammatory response and apoptosis. Conclusion Shenfu Injection has the advantages of multi-component and multi-target， and its mechanism of action in the treatment of ischemia reperfusion injury may be the activation of IL-17 and TNF signaling pathways， which can provide reference for the development of new drugs and subsequent studies.

〔Keywords〕 myocardial ischemia reperfusion injury; Shenfu Injection; network pharmacology; interleukin-17; tumor necrosis factor; β-sitosterol; ginseng saponin

心肌缺血再灌注損傷是指心肌缺血后恢復心肌血液灌注，不但沒減輕心肌損傷反而造成心肌嚴重不可逆性損傷的現象[1]。缺血性心臟病是嚴重威脅人們生命健康的疾病，近年來隨著我國社會的發展和人民生活方式的改變，缺血性心臟病發病率不斷提高，并有年輕化的趨勢，研究顯示缺血性心臟病是我國第二大死亡原因[2]。及時恢復缺血心肌的血液灌注是治療的主要策略，臨床常用冠狀動脈旁路移植術、經皮冠狀動脈介入治療、溶栓治療等及時恢復心肌血液供應，挽救壞死的心肌，臨床上取得了很好的療效，但仍無法完全防止再灌注造成的傷害。因此，尋找有效治療手段減輕心肌缺血再灌注損傷，保護心肌細胞，改善缺血性心臟病預后已成為現在國內外研究焦點。

中藥有多成分、多靶點、多通路的特點，在防治缺血再灌注損傷上有獨特優勢[3]。參附注射液是中醫學經典名方“參附湯”通過劑型改良提取而成的中藥注射液，在臨床上廣泛應用于心腦血管疾病的治療[4]。已有研究表明參附注射液能有效緩解和改善缺血再灌注損傷，有抗凋亡，保護心肌細胞的作用[5-6]，但目前參附注射液對心肌保護作用機制尚未明確。本研究旨在通過網絡藥理學預測參附注射液治療缺血再灌注損傷的主要活性成分、作用靶標和相關信號通路，并應用體外實驗驗證，揭示參附注射液治療缺血再灌注損傷的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 ?參附注射液的有效活性成分和靶點信息獲取

以“紅參”和“附子”為“Herb name”在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine

systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索，設置口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，藥物類藥性（drug likeness， DL）≥0.18，遴選有效活性成分。依據所選有效活性成分在TCMSP中篩選所得有效活性成分的靶點信息。在STRING數據庫（https：//www.string-db.org）和UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org）中檢索相應靶點信息的標準基因名。

1.2 ?缺血再灌注損傷疾病靶標信息獲取

以“ischemia reperfusion injury”（缺血再灌注損傷）為疾病檢索詞在GeneCards疾病數據庫（https：//www.genecards.org）和DisGeNET疾病數據庫（https：//www.disgenet.org）中檢索相關靶標信息，并進行匯總去重。

1.3 ?構建“參附注射液-活性成分-潛在靶點網絡”

取參附注射液與缺血再灌注損傷的交集靶標基因輸入到Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理，構建“參附注射液-活性成分-潛在靶點網絡”。

1.4 ?構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡

將參附注射液與缺血再灌注損傷的交集靶標基因輸入到STRING數據庫，選擇物種“Homo”，最低相互作用閾值選擇0.400，并選擇隱藏游離的靶點，獲取蛋白互作網絡信息。

1.5 ?GO分析和KEGG富集分析

篩選參附注射液治療缺血再灌注損傷的關鍵基因導入到R軟件的cluster profiler包進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，使用ggplot2包進行可視化分析，輸出GO富集分析包括分子功能、生物學過程、細胞組分和KEGG通路分析的氣泡圖。

1.6 ?體外實驗驗證

1.6.1 ?缺血再灌注損傷建模 ?購買30只2日齡C57BL/6小鼠乳鼠，體質量（2.05±0.37） g，飼養于廣州中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2018-0034，經廣州中醫藥大學動物實驗倫理審查委員會審批通過（許可證號：20200615），隨機分為對照組（n=8）、模型組（n=8）、β-谷甾醇組（n=7）和人參皂苷組（n=7）。提取小鼠原代心肌細胞，將心肌細胞放入無血清無糖的DMEM培養基，放入37 ℃含5% CO2、95% N2的低氧培養箱中無氧培養4 h，后置換為含糖、含胎牛血清的DMEM培養基，放置在37 ℃含95%空氣、5% CO2的培養箱中培養2 h，構建并完成心肌缺氧/復氧模型[7-9]。依據網絡藥理學研究結果，選取20 μmol/L β-谷甾醇[10]、50 μmol/L人參皂苷[11]分組給藥干預48 h。

1.6.2 ?實時定量PCR檢測 ?采用TRIzol試劑（北京智杰方遠科技有限公司，批號：15596018）提取細胞總RNA[12]，超微量分光光度計測定RNA的純度和濃度。取適量RNA按照Takara逆轉錄試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司，批號：RR047A）說明書反轉錄為cDNA。按照Takara試劑說明書（北京智杰方遠科技有限公司，批號：RR420A）操作檢測CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG mRNA，選擇GAPDH為內參基因。在實時熒光定量PCR儀（北京龍躍生物科技發展有限公司，型號：LightCycler 96）上運行RT-qPCR反應。RNA逆轉錄為cDNA的反應條件為42 ℃ 2 min和37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR的反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。CT值的計算公式為：2-ΔΔCt。以cDNA為模板，引物序列見表1。

1.6.3 ?統計學方法 ?所有統計分析都使用GraphPad Prism 5.01和SPSS 20.0進行，計數資料符合正態分布，以“x±s”表示，多組間數據比較選擇單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ?參附注射液活性成分篩選結果

在TCMSP中篩選出參附注射液有效活性成分9種。紅參有3種，包括β-谷甾醇（β-sitosterol）、人參皂苷rh2（ginsenoside rh2）、鄰苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate）;附子有6種，包括德爾妥因（deltoin）、飛燕草苷（delphin）、水黃皮素（karanjin）、去氧穿心蓮內酯（deoxyandrographolide）、谷甾醇（sitosterol）、11，14-二十碳二烯酸（11，14-eicosadienoic acid）。各有效活性成分信息依據靶標頻次降序排列見表2。

2.2 ?參附注射液治療缺血再灌注損傷的靶點預測

將檢索到的參附注射液有效活性成分在TCMSP中篩選出相應靶點信息，匯總去重后得到56個藥物作用靶點。在GeneCards疾病數據庫和DisGeNET疾病數據庫中檢索疾病靶點信息，匯總去重后得到1676個疾病靶點。將參附注射液靶點信息與疾病靶點信息進行交集映射，得到交集靶標38個。見表3。構建“參附注射液-缺血再灌注損傷交集靶標”韋恩圖。見圖1。導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“參附注射液-活性成分-靶點信息”網絡圖。見圖2。

2.3 ?構建參附注射液PPI網絡

將所得交集靶點導入STRING數據庫制作PPI網絡，設置最低相互作用閾值選擇0.400，并選擇隱藏游離的靶點，為進一步分析交集靶點間的相互作用聯系，將靶點信息導入到Cytoscape 3.7.2軟件，利用cytoHubba插件中的最大集團中心性（maximal clique centrality， MCC）算法計算分析靶點得分，依據MCC得分篩選參附注射液治療缺血再灌注損傷靶點，得到參附注射液蛋白互作網絡PPI。見圖3。篩選所得MCC得分排序見表4。

2.4 ?GO富集分析和KEGG通路富集分析

核心基因GO富集分析共獲得富集條目961條，計算各富集分析結果相對應P值，每部分P值篩選為P<0.05，排名前20的條目見圖4-6。KEGG通路富集共獲得105條富集結果，與IL-17、TNF、p53等信號通路有關，篩選排名前20的通路見圖7。運用R軟件對IL-17、TNF信號通路進行靶標通路分析。見圖8-9。

2.5 ?Q-PCR檢測TNF和IL-17信號通路相關基因表達

與對照組相比，模型組心肌細胞CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG的mRNA表達均升高（P<0.05）。與模型組相比，β-谷甾醇組心肌細胞CASP3、CASP8、AP-1的mRNA的表達均顯著降低（P<0.05）;人參皂苷組心肌細胞CASP3、IL-1β、IFNG的mRNA的表達均顯著降低（P<0.05）。見圖10。

3 討論

中醫學并無缺血再灌注損傷的病名，依據缺血性心臟病、心肌缺血再灌注損傷的臨床表現，將其歸為中醫學“胸痹”“心悸”范疇，基本病機為本虛標實，以陽氣虧虛為本，痰瘀內阻為標，治療上主張急則治其標，以活血化瘀、溫陽化氣、健脾養心為治療法則[13-14]。參附注射液是源自《校注婦人良方》之參附湯，由人參一兩、附子五錢組成，附子為辛溫大熱之品，有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛之效，是“回陽救逆第一品藥”;人參，性甘、微苦微溫，有大補元氣，復脈固脫，補脾益肺，生津養血，安神益智的功效[15]?，F代研究表明參附注射液可以強心利尿，降血壓，減輕外周血管壓力，降低心臟負荷，緩解心肌耗氧和調節心肌脂肪酸代謝的作用，可以激活超氧化物歧化酶活性，滅活氧自由基，發揮預防和治療缺血再灌注損傷的作用[16]。臨床應用上，已有臨床研究證明參附注射液在防治休克、心肌梗死、心力衰竭等心腦血管疾病上取得良好療效[17-19]。

本研究應用網絡藥理學技術探究參附注射液防治缺血再灌注損傷研究，初步預測了參附注射液治療缺血再灌注損傷的作用靶點，篩選了參附注射液所含化合物和靶點信息，構建了化合物-相關靶點網絡，預測了參附注射液治療缺血再灌注損傷的生物途徑和作用信號通路，從多角度探究了參附注射液治療缺血再灌注損傷機制。本研究預測出參附注射液有效活性成分共有9個，紅參3個（β-谷甾醇、人參皂苷、鄰苯二甲酸二正辛酯），附子6個（德爾妥因、飛燕草苷、水黃皮素、去氧穿心蓮內酯、谷甾醇、11，14-二十碳二烯酸）。四環三萜類化合物β-谷甾醇是植物甾醇的主要成分之一，有抗氧化、抗炎癥反應、降低膽固醇、調節免疫反應的作用[20]。研究表明β-谷甾醇可能作用于ERK1/2信號通路，可以上調Bcl-2/Bax、下調IL-1β、IL-6的表達，緩解缺血再灌注大鼠氧化應激反應和炎癥反應，抑制缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡[21]。人參皂苷是類固醇類化合物，主要存在于人參屬中藥中，臨床研究證實人參所含的人參皂苷能發揮類似強心苷的作用，有擴血管和擴張冠狀動脈的作用[22];Cheng等[23]通過體外實驗證明人參皂苷可抑制NF-κB的轉錄，降低相關炎癥因子的表達，對腦缺血再灌注損傷起保護作用;Wang[24]研究表明人參皂苷可調節缺血部位再灌注后血流量，通過增加谷氨酸轉運蛋白-1的表達，減少缺血部位谷氨酸攝取，抑制天冬氨酸受體的表達，從而抑制細胞內鈣超載，緩解缺血再灌注損傷。現代藥理研究發現去氧穿心蓮內酯有抑制血小板聚集、降低炎癥因子表達的作用，楊毅猛等[25]從細胞凋亡途徑研究發現穿心蓮內酯可調節高脂血癥大鼠的細胞間黏附分子-1、TNF-α;呂俊林等[26]發現穿心蓮內酯有效抑制心肌高遷移率族蛋白1、NF-κB蛋白和mRNA的表達，減輕缺血再灌注大鼠心肌的炎癥反應，起保護作用。

本研究共篩選出參附注射液作用靶點56個，與缺血再灌注損傷交集靶點有38個，通過對交集靶點構建蛋白互作網絡，分析得出相關性較高的靶標基因有CASP3、JUN、CASP8、PTGS2、IL-1β、NF-κBIA、IFNG、CD40LG、CASP1等。炎癥反應是缺血再灌注損傷的必然病理過程，現有研究表明，大鼠心肌缺血再灌注損傷會促使IL-1β的高表達，刺激內皮細胞和白細胞釋放趨化因子，使局部白細胞聚集造成局部微循環障礙，損害局部心肌細胞[27-28];此外，缺血再灌注損傷使大鼠腦部海馬區IL-1β表達會增加，實驗中人為向大鼠腦部紋狀體注射外源性IL-1β會加重大鼠缺血再灌注損傷，缺血再灌注損傷部位的IL-1β表達與炎癥損傷有正相關趨勢，因此抑制IL-1β的表達在治療缺血再灌注損傷中起重要作用[29]。PTGS有兩個亞型PTGS1和PTGS2，PTGS類靶點與人體炎癥反應和凝血反應有重要聯系[30]。Chen等[31]研究表明PTGS2在調控細胞增殖和抑制凋亡上發揮重要作用;Candelario-Jalil等[32]研究使用PTGS2抑制劑抑制PTGS2的高表達，能有效減輕缺血再灌注模型的炎癥表達。研究表明可溶性CD40配體與心血管疾病有極大關聯性，能預測心血管不良事件發生[33]，炎癥介質CD40可與膜提呈的CD40配體結合產生活性氧和活性氮，加重炎癥反應[34];基質金屬蛋白酶-9可以分解腦血管周圍基底膜，破壞血腦屏障，觸發腦缺血再灌注后損傷，而腫瘤壞死因子超基因族CD40配體是一種跨膜交換蛋白，是調控炎癥反應的重要介質，研究證明使用藥物抑制CD40或CD40配體能阻止基質金屬蛋白酶-9的激活，減少腦組織損傷[35]。生物富集分析顯示，參附注射液治療缺血再灌注損傷主要通過外源性凋亡信號通路、神經元死亡的積極調節、半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡信號通路、細胞因子受體結合等發揮作用。細胞凋亡和炎癥反應在缺血再灌注損傷中起重要作用。KEGG通路富集預測與脂質和動脈粥樣硬化、IL-17、TNF、p53、nod樣受體、VEGF、NF-κB、PI3K-Akt等信號通路有關。

結合KEGG通路富集分析和潛在作用靶點預測顯示，潛在作用靶點CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG主要富集在IL-17和TNF信號通路上。在TNF信號通路上，CASP3、CASP8、CASP1都是半胱天冬酶家族成員，是機體主要凋亡因子，而CASP3在半胱天冬酶家族發揮凋亡作用中起關鍵作用[36]，在缺血再灌注損傷病理過程中啟動細胞凋亡程序，加重機體損傷，抑制半胱天冬酶家族的表達可以抑制細胞凋亡，減輕再灌注損傷[37]。在IL-17信號通路上，細胞轉錄因子AP-1可以接受細胞膜傳導的信號通過磷酸化作用活化，活化后的AP-1進入細胞核與相應DNA序列結合，調控下游IL-1β、IFNG、IL-6、IL-8等促炎細胞因子釋放，參與炎癥反應調控[38]。體外實驗檢測參附注射液核心成分β-谷甾醇和人參皂苷對CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG的靶點有調控作用，能抑制心肌細胞在缺血再灌注的情況下發生的炎癥反應和細胞凋亡，也驗證了上面網絡藥理學的分析。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學預測了參附注射液治療心肌缺血再灌注損傷的作用機制，揭示了中藥注射液參附注射液有多成分、多靶點的優勢，并通過體外實驗驗證了參附注射液的有效活性成分可能通過下調CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG的表達，抑制IL-17和TNF信號通路上相關下游靶點活化，起到抑制炎癥反應和細胞凋亡的作用，從而起到防治心肌缺血再灌注損傷的作用。然而，基于中藥有多成分、多靶點的優勢，其更多相關作用機制仍待進一步研究。

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