卵巢癌患者外周血sHLA-G表達水平及臨床意義

周李寧，陳 彤，陳 相，洪 宏，趙 枰△

1.江蘇省南通市第一人民醫院檢驗科,江蘇南通 226001;2.江蘇省南通市中醫院檢驗科,江蘇南通 226000

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤之首，究其原因為其發病隱匿，早期癥狀不明顯致就診率低下，以及疾病進展迅速，大多數初診時已屬晚期，預后差。目前，仍缺乏有效的卵巢癌早期篩查手段，發病有年輕化的趨勢，嚴重威脅女性的生命健康。糖類抗原125(CA125)及人附睪上皮蛋白4(HE4)是目前臨床應用最為廣泛的卵巢癌診斷及預后評估的血清學指標，但其受干擾因素較多，診斷準確性不高，卵巢癌確診除了手術病理仍依賴于有創傷性的穿刺活檢。外泌體是由細胞分泌的一種囊泡樣小體，起初被認為是細胞分泌垃圾的方式，隨后研究發現其攜帶多種生物活性分子，并介導著細胞間的信號傳遞，其功能的研究備受關注[1]。外泌體廣泛存在于血液、尿液、唾液、腹水、胸腔積液等體液中，具有穩定性好、腫瘤特異性高及與腫瘤的分期和預后相關等優勢，有望成為新的腫瘤特異性早期診斷標志物[2]。血漿來源的外泌體可表達一些免疫抑制分子，調節免疫細胞的功能，破壞機體抗腫瘤的免疫力[3]。有報道顯示，卵巢癌患者血漿外泌體中富含白細胞介素(IL)-10、轉化生長因子β1(TGF-β1)等免疫抑制因子[4]。人類白細胞抗原(HLA)-G屬于非經典HLA Ⅰ類分子，其初始轉錄產物經剪切后可編碼產生4種膜結合型和3種可溶性型異構體，是免疫抑制分子之一，可通過與免疫細胞上的受體結合，抑制自然殺傷細胞的活性、效應性T細胞的增殖，誘導調節性T細胞的產生及相關細胞因子的釋放等方式參與機體的免疫耐受和腫瘤的免疫逃逸[5-6]。有研究表明，HLA-G不僅表達于腫瘤細胞表面、游離在體液中，還可被整合進外泌體中[7]。但有關卵巢癌患者外泌體可溶性HLA-G(sHLA-G)的功能及臨床意義報道甚少。本研究通過檢測卵巢癌患者外周血(血漿及外泌體)中sHLA-G的表達水平并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年12月南通市第一人民醫院(以下簡稱本院)收治的卵巢癌患者41例及卵巢良性腫瘤患者34例分別作為卵巢癌組及卵巢良性腫瘤組。卵巢癌組患者抽血前均未應用激素治療及放化療，術后有明確病理診斷，病歷資料完整；年齡32～75歲，平均(55.7±12.6)歲；病理類型：漿液性癌19例，非漿液性癌22例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期26例；病理分化程度：低分化25例，中、高分化16例。卵巢良性腫瘤組患者年齡35～73歲，平均(50.9±11.4)歲，均排除心、肝、腎等重要臟器疾病及糖尿病等慢性疾病。另選取本院體檢中心體檢健康女性30例作為健康對照組，年齡36～71歲，平均(50.4±13.8)歲。3組年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有受試者對本研究知情并簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會審批通過。

1.2儀器與試劑 FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司。exoEasy Maxi試劑盒購自德國Qiagen公司，PE-Cy7-CD63、Fc受體阻斷劑購自美國BD公司，FITC-2A12/HLA-G購自捷克Exbio公司，乳膠微粒購自美國Life Technologies公司，sHLA-G 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自捷克BioVendor公司。

1.3方法

1.3.1外泌體提取 采集健康體檢者體檢時及患者術前外周血約2 mL，使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，混勻，1 000×g離心10 min，取血漿約1 mL，按照exoEasy Maxi試劑盒說明書操作提取血漿外泌體，洗脫液洗脫至EP管中，-70 ℃冰箱保存備用。

1.3.2FCM檢測外泌體sHLA-G 在流式管底部依次加入含外泌體的洗脫液100 μL，磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL，輕輕渦動混勻約3 s，靜置15 min；加入乳膠微粒溶液5 μL，搖擺孵育30 min，再加入含甘氨酸的BSA溶液1 mL，輕輕渦動混勻約5 s，孵育30 min，3 000×g離心5 min，棄上清，PBS洗滌3次，每次迅速回正，避免乳膠微粒丟失，流式管中約剩200 μL，加入Fc受體阻斷劑5 μL，封閉10 min，加入PE-Cy7-CD63抗體和FITC-2A12/HLA-G抗體各5 μL，輕輕渦動混勻約10 s，室溫避光孵育1 h，500×g離心5 min，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，200 μL緩沖液重懸，上機檢測。sHLA-G表達情況以sHLA-G陽性所占CD63陽性比例計，CD63陽性為外泌體標志物。

1.3.3ELISA檢測血漿sHLA-G 表達水平 嚴格按照sHLA-G ELISA試劑盒說明書操作,設置空白管、標準管和待測樣品孔對血漿sHLA-G 表達水平進行檢測，底物顯色后用酶標儀450 nm 波長測定各孔吸光度，再由標準曲線計算出血漿sHLA-G 水平。

2 結 果

2.13組外周血外泌體sHLA-G陽性占比比較 FCM檢測結果顯示，卵巢癌組外周血外泌體sHLA-G陽性占比為(73.8±14.7)%，良性腫瘤組為(45.8±11.2)%，健康對照組為(42.9±9.3)%，3組差異有統計學意義(P<0.01)；卵巢癌組明顯高于良性腫瘤組和健康對照組(P<0.05)，而良性腫瘤組與健康對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.23組血漿sHLA-G水平比較 ELISA檢測結果顯示，卵巢癌組血漿sHLA-G水平為118.7(80.3，163.4)U/mL，良性腫瘤組為44.3(36.6，51.4)U/mL，健康對照組為41.7(30.6，47.8)U/mL，3組差異有統計學意義(P<0.01)；卵巢癌組明顯高于良性腫瘤組和健康對照組(P<0.01)，而良性腫瘤組與健康對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3不同臨床病理特征卵巢癌患者外周血sHLA-G水平比較 不同臨床分期卵巢癌患者外泌體sHLA-G陽性占比比較，差異有統計學意義(P<0.05)；不同病理分化程度卵巢癌患者血漿sHLA-G比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。Spearman相關分析顯示，外泌體sHLA-G與血漿sHLA-G無相關性(r=0.321，P>0.05)。

表1 不同臨床病理特征卵巢癌患者外周血sHLA-G水平比較

3 討 論

sHLA-G包括1種由基質金屬蛋白酶水解HLA-G1跨膜肽鏈脫落產生的shedded HLA-G1，以及3種缺乏跨膜區、細胞質區的以分泌可溶性形式存在的HLA-G5、-G6、-G7[8]。sHLA-G能在多種體液中被檢測到,包括外周血、尿液、腹水等，血液或體液sHLA-G通過與相應受體結合，可直接發揮免疫抑制效應，亦可誘導調節性T細胞產生及某些細胞因子釋放間接發揮長效的免疫抑制作用[9]。sHLA-G異常表達與機體的多種生理、病理過程相關,從最初的母胎界面的免疫耐受到一些免疫豁免組織相關的感染免疫、移植免疫及自身免疫性疾病等，進一步延伸至腫瘤細胞的免疫逃逸等[10-11]。有研究顯示，腫瘤細胞自身可以分泌sHLA-G，在大多數實質性腫瘤的病灶區或患者體液中均可檢測到sHLA-G的高表達，其發揮著免疫抑制效應，影響腫瘤發生部位微環境及外周循環系統的抗腫瘤免疫應答[12-13]。有研究表明，在卵巢癌患者的惡性腹水中sHLA-G水平呈高表達，sHLA-G水平可以預測卵巢癌的預后，原發性卵巢癌組織中HLA-G表達亦明顯增高，體外培養卵巢癌細胞系SKOV3細胞毒試驗顯示，HLA-G可通過抑制NK92的溶細胞作用，表現為免疫抑制效應使卵巢癌細胞免疫逃逸，提示sHLA-G可作為卵巢癌一個潛在的腫瘤標志物[14]。外泌體是源于細胞膜內陷形成并分泌的多囊泡，含有膜脂質、蛋白質及細胞質中的蛋白質、核酸等，癌癥狀態下腫瘤細胞源性外泌體的釋放量增多，并載有大量腫瘤細胞來源的生物信息，實現腫瘤與微環境中細胞間的交流[15-16]。多項研究表明，卵巢癌源性外泌體攜帶CA125、上皮細胞黏附分子等腫瘤標志物，還攜帶激活轉錄因子2、腫瘤轉移相關基因1等促進血管生成因子，亦有唾液酸糖蛋白、四跨膜蛋白與細胞連接、靶細胞的選擇相關，以及熱休克蛋白、IL-10、TGF-β1與腫瘤免疫調節相關等[17-19]。腫瘤源性外泌體HLA-G的研究尚屬起步階段，相關研究拓寬了sHLA-G參與腫瘤免疫并發揮免疫抑制作用機制的研究途徑。有研究表明，外泌體源性sHLA-G與非外泌體源性sHLA-G在腫瘤患者體內可能具有不同的臨床意義[20]。同樣卵巢癌外泌體源性sHLA-G檢測可能為腫瘤的診療提供新的思路。

目前,血漿sHLA-G水平在多種疾病中的診斷價值已被廣泛研究,尤其在腫瘤方面，如肺癌、胃癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等多種癌癥患者血漿sHLA-G水平均增高,說明sHLA-G作為某種癌癥診斷標志物的特異度不高，但可作為卵巢癌診斷的潛在生物標志物之一。本研究結果發現，外泌體sHLA-G與血漿sHLA-G無相關性，這可能是由于兩種方法的檢測原理不同所致，FCM主要檢測乳膠微粒富集的外泌體中HLA-G5、-G6熒光信號，而ELISA檢測的是血漿中HLA-G5和shedded HLA-G1的總量，亦表明不同的HLA-G異構體分子在卵巢癌中可能起著不同的生物學作用；不同病理類型卵巢癌患者外周血sHLA-G差異無統計學意義(P>0.05)，表明雖然不同組織學類型卵巢腫瘤的生物學行為存在很大差異，但它們發揮免疫抑制效應使卵巢癌細胞免疫逃逸的行為是一致的；卵巢癌病理分期Ⅲ～Ⅳ期患者的外泌體sHLA-G陽性占比高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，即卵巢癌臨床分期越晚，外泌體sHLA-G的表達越多，提示外泌體sHLA-G可能參與了疾病的進展，有助于腫瘤的轉移與擴散；不同病理分化程度卵巢癌患者血漿sHLA-G水平差異有統計學意義(P<0.05)，可反映卵巢癌患者不良預后，與臨床結局相關。上述結果提示血漿sHLA-G和外泌體sHLA-G有著不同的臨床應用價值。

FCM檢測外泌體sHLA-G在卵巢癌診斷上具有潛在的價值，為臨床提供了另一種備選方法，提示外泌體sHLA-G可能成為卵巢癌診斷的新指標。本研究還存在一些不足之處，如研究樣本量相對較少，未分析外周血sHLA-G水平與卵巢癌患者預后關系，未分析卵巢癌患者手術前后外周血sHLA-G水平的變化，以及其與卵巢癌生存率的相關性等。后續研究將擴大樣本量驗證，并探討外泌體來源的sHLA-G在卵巢癌中的生物學作用及機制，以進一步明確其在卵巢癌診斷中的價值。

綜上所述,卵巢癌患者外周血sHLA-G水平顯著增高,表明sHLA-G在卵巢癌的發生、發展中發揮著重要的作用，有望成為卵巢癌診斷的潛在腫瘤標志物。