新型冠狀病毒核酸檢測的性能驗證及評價

周 丹，何進才，李惠貞，黃 濤，谷大偉，張德明，羅勝華

廣東省深圳市中醫院檢驗科，廣東深圳 518033

《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版修訂版)》[1]指出，對疑似病例采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)核酸為陽性即可確診為SARS-CoV-2感染。核酸檢測具有早期、靈敏度高、特異度高、易操作等優勢，但對于核酸檢測結果的準確性，還需要從標本類型、質量、實驗因素、試劑盒性能及患者感染周期等因素來綜合分析[2]，尤其難診斷的病例應當更加嚴格地控制。性能驗證是保證實驗室開展的檢驗項目所應用的檢測系統的分析性能或檢驗項目的方法學能夠滿足檢測及臨床需求，保證患者標本檢測結果準確可靠所進行的一系列驗證試驗。性能驗證參數至少應包括精密度、符合率和檢出限，同時需要在臨床檢測過程中累積室內質量控制和臨床標本檢測得到的數據，并與其他實驗室間結果進行對比，開展進一步評價和其他性能指標(如特異度、抗干擾能力等)驗證[3]。

為了驗證本實驗室采用的SARS-CoV-2核酸檢測系統的各項性能參數是否符合要求，本研究參照《醫學實驗室 質量和能力的要求》第1部分通用要求GB/T22576.1-2018[4]、第10部分分子生物檢驗學領域的要求GB/T22576.10-2018、《CNAS-CL02-A009:2018醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》[5]等文件要求對本實驗室SARS-CoV-2 RT-qPCR檢測系統的符合率、重復性、檢出限、抗干擾能力、交叉反應等性能特征進行驗證及評價，現報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 國家衛生健康委臨床檢驗中心(以下簡稱國家臨檢中心)2020年第1、2次SARS-CoV-2核酸檢測室間質評標本，廠家提供的SARS-CoV-2核酸企業參考品(可溯源)，SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒陰、陽性對照，廣州邦德盛SARS-CoV-2核酸弱陽性質控品，本實驗室檢測SARS-CoV-2核酸陰性標本等。所有標本放-70 ℃冰箱內保存備用，避免反復凍融。

1.2儀器與試劑 核酸提取和擴增均采用廈門安普利全自動核酸提純及RT-qPCR分析系統(Anadas9850)，核酸提取試劑購自廈門安普利生物科技有限公司，檢測試劑為上海伯杰醫療科技有限公司SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(RT-qPCR法，批號：20200604)。

1.3方法 參考《醫學實驗室 質量和能力的要求》第1部分通用要求GB/T22576.1-2018、第10部分分子生物檢驗學領域的要求GB/T22576.10-2018、CNAS-CL02-A009:2018《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》和CNAS-GL039:2019《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》[6]的要求，對SARS-CoV-2核酸檢測系統的主要性能指標進行驗證。

1.3.1符合率驗證 選取國家臨檢中心2020年第1、2次SARS-CoV-2核酸檢測室間質評標本用于符合率驗證，共計20份，其中陰性標本8份，陽性標本(含弱陽性和強陽性標本)12份。以國家臨檢中心公布的結果為靶值，分別計算陽性符合率、陰性符合率和總體符合率，檢測結果應在允許范圍內，且總體符合率>90%。

1.3.3檢測下限驗證 將廠家提供的企業參考品(可溯源，濃度105copies/mL)用無RNA酶DEPC水梯度稀釋200倍至廠家聲明的檢出限濃度500 copies/mL，并進行檢測下限的驗證，同一批次重復測定5次，需達到100%檢出率。

1.3.4交叉反應驗證 由于用于交叉反應驗證的病毒屬于高致病性及傳染性病毒，且不易獲取，考慮到在二級生物安全實驗室進行這些病毒操作的風險，故本研究選取國家臨檢中心第1次SARS-CoV-2病毒核酸檢測室間質評的2020001、2020005、2020006、2020007、2020012號標本用于交叉反應的驗證。這5份標本中在室間質評標本結果回饋后，已知其中含有的病原體的真實成分，且經過滅活處理，對操作人員無致病性。分別吸取200 μL標本加入200 μL標本保存液或經確認為陰性的標本中充分混勻，與常規樣品一起處理和檢測，重復檢測3次以上，檢測結果需均為陰性，則交叉反應驗證通過。

1.3.5抗干擾能力驗證 將制備的干擾物質溶液混入弱陽性質控品中進行抗干擾能力的驗證。本研究對內源性干擾物質血液和黏蛋白進行抗干擾能力驗證。血液干擾液制備：取1 mL血液，加入1 mL弱陽性質控標本中混勻，制成混有50%血液的干擾物質溶液。黏蛋白干擾液的制備：稱取黏蛋白315 mg，加入100 mL超純水，混合均勻，制成3.15 mg/mL溶液，再取3.15 mg/mL溶液100 μL加入3.4 mL弱陽性質控標本中，混合均勻，制成含黏蛋白質量濃度為0.9 mg/mL干擾物質溶液。將以上含干擾物質溶液的標本重復測定2次以上。若檢測結果仍為弱陽性，說明在混有血液≤50%、黏蛋白≤0.9 mg/mL等內源性干擾物質時，不影響檢測結果的判讀，對測定無顯著影響。

1.4質控和結果判讀 所有檢測批次試驗均需做3個陰性、1個弱陽性質控，質控在控，結果才有效，否則需要重新檢測。同一實驗中，需同時滿足陰性對照FAM通道、HEX/VIC通道無Ct值，ROX通道不做要求；弱陽性質控FAM通道、HEX/VIC通道、ROX通道均有擴增曲線，且Ct值≤40等要求，否則本次實驗無效。在符合質控要求的條件下進行結果的判讀，FAM通道和HEX/VIC通道Ct值≤40，SARS-CoV-2核酸檢測陽性；FAM通道和HEX/VIC通道無Ct值或Ct值>40，SARS-CoV-2核酸檢測陰性；FAM通道無Ct值或Ct值>40，和HEX/VIC通道Ct值≤40或者FAM通道Ct值≤40和HEX/VIC通道無Ct值或Ct值>40(即單靶標陽性)時需要復測，如果復測結果仍為單靶標陽性，則判定為SARS-CoV-2核酸檢測陽性；若復測后雙靶標Ct值>40，則判定為SARS-CoV-2核酸檢測陰性。

1.5統計學處理 采用Excel 2019和SPSS19.0軟件進行數據整理和統計學分析，經檢驗計量資料呈正態分布，計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.01為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1符合率驗證 國家臨檢中心發放的20份室間質評標本(陽性12份，陰性8份)，本實驗室檢測出陽性11份(其中弱陽性4份)，陰性9份，以國家臨檢中心公布的結果為金標準，陽性符合率=92%，陰性符合率=100%，總符合率=95%，2種方法的檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=16.29，P<0.01)。該方法的靈敏度為92%，特異度為100%，約登指數為0.92。見表1、2。

表1 SARS-CoV-2核酸檢測符合率驗證結果

表2 SARS-CoV-2核酸檢測符合率驗證實驗統計(n)

2.2重復性(精密度)驗證 2份標本中，一份為陰性，另一份為弱陽性(濃度約為104 copies/mL)，進行批內和批間重復性(精密度)驗證，試劑盒檢測的2個靶基因ORF-1ab和N的Ct值結果見表3。陰性標本檢測結果均為陰性，弱陽性標本的2個靶基因ORF-1ab和N的Ct值的批內CV分別為1.38%和1.16%，批間CV分別為1.84%和1.72%，均小于5%，與試劑說明書聲稱的實驗室內、室間的精密度CV≤5%符合，重復性(精密度)驗證通過。

表3 SARS-CoV-2核酸檢測重復性(精密度)驗證結果(Ct值)

2.3檢測下限(靈敏度)驗證 重復檢測5次檢出限濃度500 copies/mL的標本，檢測結果均為陽性，滿足說明書聲稱的最低檢測限要求，檢測下限驗證通過。見表4。

表4 SARS-CoV-2核酸檢測下限驗證結果

2.4交叉反應驗證 將200 μL標本加入200 μL保存液或經確認為陰性的標本中充分混勻，與常規標本一起處理和檢測，重復檢測3次，檢測結果見表5。5個標本檢測結果均為陰性，在加入其他病原體后，對檢測結果的判讀不造成影響，滿足試劑說明書中的要求，交叉反應驗證通過。

表5 SARS-CoV-2核酸交叉反應驗證結果

2.5抗干擾驗證 在弱陽性標本中加入干擾物質溶液，使干擾物質的終濃度與廠家聲明的濃度相同，將該弱陽性標本重復測定2次，檢測結果見表6。加入干擾物質后的弱陽性標本均能檢測出陽性結果，說明在混有血液≤50%、黏蛋白≤0.9 mg/mL等內源性干擾物質時，不影響檢測結果的判讀，對測定無顯著影響，滿足試劑說明書中的要求，抗干擾驗證通過。

表6 SARS-CoV-2核酸檢測抗干擾驗證實驗結果

3 討 論

性能驗證是指實驗室通過實驗數據驗證檢驗程序的性能特征是否符合廠商的聲明。《醫學實驗室 質量和能力的要求》第1部分通用要求GB/T22756.1-2018[4]指出，檢驗方法或試劑在使用前必須經過實驗室獨立驗證，以確保其性能指標在本實驗室能達到廠商聲明的要求。因此，性能驗證不僅是實驗室認可的需要，也是確保檢測結果準確可靠的內在要求。

在進行符合率驗證時，可通過與參比方法進行比較，來判定檢測結果的符合率，參比方法通常為診斷的金標準、行業公認方法、經性能驗證符合要求能滿足臨床預期用途的方法，如通過ISO15189認可實驗室使用的相同檢測方法等。在實際工作中，通常采用參加國家/省臨檢中心室間質量評價標本結果來進行評價，檢測國家/省臨檢中心質評物，檢測結果均在允許范圍中，則符合率驗證通過。本研究采用國家臨檢中心發放的室間質評標本進行驗證，共20份標本，其中陰性8份，陽性12份，本研究檢測到陽性11份，陰性9份，陽性符合率92%，陰性符合率100%，總符合率95%，其中有1例陽性標本未檢測出陽性，根據國家臨檢中心最后公布的結果可知，該標本的真實成分是SARS-CoV-2，其數字PCR定量的濃度是128 copies/mL，已經低于了本檢測系統的最低檢測限500 copies/mL，未檢測出陽性結果在可接受范圍內，同時也說明了RT-qPCR檢測出核酸的靈敏度還有待提高。此外，還可采用廠商或第三方提供的參考物質的檢測來進行符合率的驗證。但是，符合率的驗證并不等同于正確度的驗證，在《WS/T505-2017:定性測定性能評價指南》[7]中也提到，符合率的一個重要缺陷是其并不是一個“正確性”的量度，事實上2種檢測方法可能高度符合，但是靈敏度和特異度都很低，相反，2種方法不符合也并不意味著待評估的方法是錯誤的，比較方法是正確的。其次，在采用室間質評標本進行研究方法的檢測性能驗證時，由于室間質評標本存在基質效應，可能會帶來2種方法比對時結果不一致的錯誤結論，例如室間質評標本中分析物水平在接近陰性或陽性閾值時，可能無法檢測出真實結果。

精密度是在規定條件下，對同一檢測對象多次重復測量所得到的結果的一致程度，通常以s或CV表示[8]。定性項目的精密度評價應選擇接近臨界水平的標本進行試驗，每次試驗均應設立陰性和陽性質控，質控數據在控為試驗數據有效的前提。在疫情防控常態化時期，由于本院為非定點收治醫院，陽性標本不易獲得，因此本研究用無RNA酶DEPC水10倍稀釋廠家提供的企業參考品(可溯源，濃度105copies/mL)獲得濃度104copies/mL的弱陽性標本用于重復性驗證，結果顯示2個靶基因ORF-1ab和N的Ct值的批內CV分別為1.38%和1.16%，批間CV分別為1.84%和1.72%，均小于5%，符合廠家聲明，說明試劑性能穩定，重復性較好。

當所有檢驗程序在廠家試劑使用說明書等有聲明檢出限時，檢測項目在有標準物質時，或以定量形式表達定性結果時，應進行檢出限的驗證。對檢出限的驗證，也是對檢測系統靈敏度的驗證。靈敏度是指儀器或試劑對待測標本的檢測能力，若靈敏度過低，則可能導致假陰性出現[9-10]。用于檢測限驗證的標本應是定值標準物質(國際參考品、國家參考品、廠家參考品)，將定值標準物質梯度稀釋至廠家聲明的檢出限濃度，重復測定5次或在不同批次內對該標本進行20次重復測定，如果是5次重復，則需達到100%檢出率，如果是分批次20次檢測，需至少18次檢出核酸，檢出率90%以上。本研究用無RNA酶DEPC水梯度稀釋廠家提供的企業參考品(可溯源，濃度105copies/mL)200倍至廠家聲明的檢出限濃度500 copies/mL，用于驗證檢出限，重復測定5次的檢測結果均為陽性，滿足說明書的檢測限要求，說明該試劑具有足夠的檢測能力。

交叉反應驗證需驗證于檢測對象可能存在交叉反應的病原體對檢測的影響，這類病原體主要是與檢測對象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的病原體，并宜在病原體感染的醫學決定水平進行驗證。本研究運用了國家臨檢中心2020年第1次SARS-CoV-2核酸檢測的室間質評標本，在室間質評結果回饋后已知其中一些陰性標本的真實成分，這些病原體剛好可用于交叉反應驗證，且都經過滅活處理，對操作人員無致病性。本研究分別吸取200 μL已知病原體標本加入200 μL標本保存液或經確認為陰性的標本中充分混勻，與常規樣品一起處理和檢測，重復檢測3次的檢測結果均為陰性，檢測結果可接受，交叉反應驗證通過。

抗干擾能力驗證應驗證說明書中涉及干擾物質對測定的影響，常見干擾物質主要包括血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素、免疫球蛋白、類風濕因子、黏蛋白、抗核抗體和藥物等。SARS-CoV-2核酸檢測一般采集的標本為鼻咽或口咽拭子，可能存在血紅蛋白或黏蛋白的干擾，因此在本研究中驗證了血液和黏蛋白2種內源性干擾物質的影響，在弱陽性標本中加入干擾物質溶液，使干擾物質的終濃度與廠家聲明的濃度相同，將含有干擾物質的弱陽性標本重復測定2次，檢測結果仍為弱陽性，說明在混有血液≤50%、黏蛋白≤0.9 mg/mL等內源性干擾物質時，不影響檢測結果的判讀，對測定無顯著影響，滿足試劑說明書中的要求。

綜上所述，核酸檢測是SARS-CoV-2診斷的重要方法。本研究結果顯示該檢測系統的結果準確可靠，精密度好，靈敏度高，抗干擾能力強，與試劑說明書提供的檢測性能一致，可以滿足目前SARS-CoV-2初篩檢測的要求。本研究提供了一套SARS-CoV-2核酸檢測的性能驗證方案，在陽性標本不易獲取的條件下可以適當使用室間質評的標本進行檢測系統的性能驗證。檢測系統的性能驗證或評價不僅是實驗室認可的需求，更是保證檢測結果準確可靠的需求，實驗室應建立文件化的性能驗證程序，注意性能驗證的時機，制訂相應的驗證方案，在開展新項目時做好性能評價。