食管癌患者血清miR-3653-3p和miR-330-3p的作用及臨床意義

吳 軍，戴 明

上海復旦大學附屬中山醫院吳淞醫院腫瘤內科，上海 200940

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，也是全球范圍內發病率和病死率較高的惡性腫瘤。食管癌患者早期大多數沒有癥狀或者僅有輕微不適，發展到一定程度才出現典型的吞咽困難的癥狀[1-2]，在確診時往往已屬于中晚期，而且部分發生了腫瘤轉移，5年生存率不足10%[3]。因此，早發現、早治療是提高食管癌預后的關鍵[4]。目前，食管癌的診斷尚缺乏敏感和特異的指標，因此尋找早期診斷和預后判斷的指標成為研究的熱點。微小RNA(miRNA)由20～22個核苷酸組成，是一種非編碼RNA，其通過與信使RNA(mRNA)特異性結合，調節mRNA的翻譯，從而調節基因表達，參與疾病的病理生理過程。有研究顯示，miRNA可以調控超過60%的人類編碼蛋白，表現出一定的血清穩定性[5]。miR-3653在食管癌中呈低表達[6]，miR-330-3p在食管癌中呈高表達[7]，但二者是否具有診斷和預測預后的功能仍不清楚。本研究通過聯合檢測血清miR-3653-3p和miR-330-3p表達水平，觀察其在診斷食管癌和預測預后的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2017年6月在本院行手術治療的食管癌患者109例作為食管癌組，其中男66例，女43例；年齡35～79歲，平均(58.57±5.68)歲；腫瘤部位：頸部2例，上段7例，中段64例，下段36例；組織分化程度：低分化30例，中分化45例，高分化34例；腫瘤TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期25例，Ⅲ期39例和Ⅳ期33例。另選取同期在本院行手術治療的食管良性病變者65例作為食管良性病變組，其中男38例，女27例；年齡(57.96±6.45)歲，平均(57.96±6.45)歲；疾病類型：食管平滑肌瘤8例，反流性食管炎51例和食管息肉6例。同時選取本院體檢健康者30例作為對照組，其中男19例，女11例；年齡33～79歲，平均(58.27±6.18)歲。食管癌組和食管良性病變組患者納入標準：均行病理確診；臨床資料完整；依從性較好。排除標準：其他部位的腫瘤；免疫性和血液性疾病；肝炎和肺炎等急、慢性感染；術前接受、放化療或靶向治療。所有受試者均對本研究知情并簽署知情同意書。3組年齡、性別等基線資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1血液標本留取 于食管良性病變組入院后、食管癌組手術前后，以及對照組體檢當日抽取肘靜脈血5 mL。采用離心機3 000 r/min離心15 min，離心半徑15 cm，然后抽取上清液移入除酶管內，放置于-70 ℃冰箱中保存。采用全自動生化儀(免疫比濁法)檢測尿蛋白和尿肌酐水平。

1.2.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 總RNA提取：取受試者血清400 μL，采用TaqMan miRNA試劑盒提取血清總RNA。引物由上海化生有限公司合成，miR-3653-3p上游引物為5′-CUAAGAAGU UGACUGAAG-3′，下游引物為5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；miR-330-3p上游引物為5′-GCCAACAATATCCTGGTGCTG-3′，下游引物為5′-GAGGTATTCGCACTGGATACGACTCTCTG-3′；U6上游引物為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。逆轉錄反應：選擇逆轉錄酶1 μL，RNA 5 μL和引物3 μL，在15 μL反應體系中，采用美國ABI TaqMan PreAmp Master Mix進行cDNA擴增。反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。取逆轉錄產物配制20 μL反應體系，于RT-qPCR儀中進行反應。反應條件：95 ℃預變性15 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，連續40個循環。每個樣品檢測3次，以2-ΔΔCt表示相對表達量。

1.3觀察指標 觀察比較各組血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平，手術前后、3年隨訪時食管癌組患者血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平，以及不同臨床特征食管癌患者血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平。

2 結 果

2.1各組血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平比較 食管癌組患者術前血清miR-3653-3p水平明低于食管良性病變組和對照組(P<0.01)，食管良性病變組低于對照組(P<0.01)；而食管癌組患者術前血清miR-330-3p水平高于食管良性病變組和對照組(P<0.01)，食管良性病變組高于對照組(P<0.01)，食管癌組患者術后1周血清miR-3653-3p水平較術前明顯升高(P<0.01)，miR-330-3p水平較術前明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平比較

2.2血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平對食管癌的診斷效能 血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平對食管癌具有較高的診斷效能，miR-3653-3p和miR-330-3p聯合檢測的靈敏度為79.8%，特異度為90.8%，曲線下面積(AUC)為0.916，AUC明顯高于miR-3653-3p、miR-330-3p單獨檢測。見圖1和表2。

表2 血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平對食管癌的診斷效能

圖1 血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平診斷食管癌的ROC曲線

2.3不同臨床特征食管癌患者血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平比較 不同腫瘤最大徑、組織學分級、腫瘤分期和淋巴轉移食管癌患者血清miR-3653-3p和miR-330-3p比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 不同臨床特征食管癌患者血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平比較

2.43年隨訪存活組和死亡組食管癌患者血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平比較 存活組血清miR-3653-3p水平明顯高于死亡組(P<0.01)，而血清miR-330-3p水平明顯低于死亡組(P<0.01)。見表4。

表4 3年隨訪存活組和死亡組食管癌患者血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平比較

2.5血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平對食管癌患者預后的預測效能 血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平在預測食管癌患者3年內死亡方面具有較高的診斷效能，聯合檢測的靈敏度為96.6%，特異度為72.0%，AUC為0.919，AUC明顯高于miR-3653-3p和miR-330-3p單獨檢測。見圖2、表5。

表5 血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平對食管癌患者3年內死亡的預測效能

圖2 血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平預測3年內出現死亡的ROC曲線

3 討 論

miRNA是一種具有組織特異性和發育時段特異性的非編碼RNA，不僅對人的生理活動有重要影響，而且在腫瘤的發生、發展中起重要作用。有研究發現，miRNA主要通過降解mRNA來調控細胞的病理生理過程，這些靶基因具有促癌基因和抑癌基因的作用，miRNA對腫瘤的作用機制主要分為2種[8-9]：(1)促癌基因miRNA。目前研究比較多的促癌基因如miR-21，其在乳腺癌和肝癌等出現高表達。本研究中miR-330-3p在食管癌組呈高表達，明顯高于良性食管病變組和對照組，并且不同腫瘤最大徑、組織學分級、腫瘤分期和淋巴轉移食管癌患者血清miR-330-3p水平差異有統計學意義(P<0.05)，說明miR-330-3p水平為促癌基因。(2)抑癌基因miRNA。常見的基因如let-7家族，其表達上調抑制癌細胞增殖。本研究中食管癌患者血清miR-3653-3p水平較食管良性病變組和對照組明顯降低，并且發現不同腫瘤最大徑、組織學分級、腫瘤分期和淋巴轉移食管癌患者血清miR-3653-3p水平差異有統計學意義(P<0.05)，說明miR-3653-3p為抑癌基因。根據miRNA作用于促癌基因及抑癌基因的特點，miRNA作用于腫瘤存在2種模式[10]：miRNA表達下調，對應促癌基因表達上調，促進腫瘤的發生；miRNA表達上調，抑癌基因出現下調，同樣促進腫瘤的發生。有研究表明，一個miRNA可以調控多個靶mRNA，同樣一個靶基因可以接受多個miRNA的調控[11]。這種多種、發散的調控模式使miRNA對機體的調控更為精密，同樣調控腫瘤，影響抑癌基因和促癌基因，更為精確地調控腫瘤的發生、發展。

miRNA在基因轉錄調控方面具有重要作用，越來越多的研究證實異常表達的miRNA可以作用腫瘤診斷和預后預測的重要分子標志物[12]。本研究結果顯示，食管癌組患者血清miR-3653-3p水平較食管良性病變組和對照組明顯降低，而手術后血清miR-3653-3p水平較術前明顯升高，說明miR-3653-3p是腫瘤發生的保護因子，表現出抑癌基因的特性。miR-3653-3p診斷食管癌的靈敏度為81.7%，特異度為72.3%，AUC為0.838，具有較高的診斷效能。現已知miR-3653定位于22號染色體，在本研究中食管癌患者miR-3653呈低表達，與文獻報道其在肺癌中呈低表達一致[13]。有研究認為，miR-3653-3p表達可抑制腫瘤細胞的惡性表型，而敲除miR-3653-3p基因后出現相反的表型[14]。本研究還發現，食管癌生存組患者血清miR-3653-3p水平明顯高于死亡組，并且血清miR-3653-3p預測食管癌患者3年內出現死亡的靈敏度為98.3%，特異度為64.0%，AUC為0.844，說明血清miR-3653-3p水平對食管癌患者預后有較高的預測效能。

本研究顯示，食管癌組患者血清miR-330-3p表達水平明顯高于食管良性病變組，食管癌組患者術后血清miR-330-3p表達水平出現明顯降低，說明miR-330-3p表現為促癌基因功能，其表達與食管癌具有一定的聯系。在一項基因芯片的研究中發現，食管鱗狀細胞癌組織miR-330-3p表達明顯上調，并認為其表達具有一定的組織特異性[15]。miR-330-3p在其他腫瘤的表達中存在一定的爭議，在膠質瘤和腦轉移瘤中miR-330-3p呈高表達[16]，而在前列腺癌中呈低表達[17]，故miR-330-3p在不同組織中可能有不同的作用。本研究顯示，血清miR-330-3p診斷食管癌的靈敏度為78.0%，特異度為86.2%，其AUC為0.878，說明血清miR-330-3p表達水平對食管癌具有一定的診斷價值。在對非小細胞肺癌的研究中發現，腫瘤組織中miR-330-3p呈高表達，在轉染miR-330-3p后能夠促進腫瘤細胞的增殖和遷移，在對有無腦組織轉移非小細胞肺癌的研究中發現，腦組織轉移非小細胞肺癌患者miR-330-3p表達是無腦轉移患者的53倍，說明miR-330-3p在非小細胞肺癌惡性表型和腦轉移方面具有重要作用[18]。血清miR-330-3p表達水平在診斷食管癌方面的研究miR-330-3p仍較少[19]，在診斷食管癌和預測其預后方面是否有價值仍需要進一步確認。本研究顯示，在3年內死亡的食管癌患者血清miR-330-3p表達水平明顯低于生存者，并且血清miR-330-3p預測食管癌患者3年內出現死亡的靈敏度為76.3%，特異度為88.0%，AUC為0.875。

本研究結果還顯示，miR-3653-3p和miR-330-3p聯合檢測診斷食管癌的效能明顯高于miR-3653-3p和miR-330-3p單獨檢測，其靈敏度為79.8%，特異度為90.8%，AUC為0.916說明聯合診斷能夠明顯提高診斷效能。另外，miR-3653-3p和miR-330-3p聯合檢測對食管癌患者3年內出現死亡的預測效能同樣比單個指標miR-3653-3p和miR-330-3p明顯增高，其靈敏度為96.6%，特異度為72.0%，AUC為0.919，說明聯合檢測能提高預測食管癌患者3年內出現死亡的效能。說明2個指標存在某種互補，但具體機制需要進一步研究。

綜上所述，miR-3653-3p和miR-330-3p在食管癌中的作用類似抑癌基因和促癌基因，聯合檢測血清miR-3653-3p和miR-330-3p表達水平在診斷食管癌和預測3年內死亡具有重要臨床價值。