牛呼吸道合胞體病毒RT-PCR檢測方法的建立及初步應用

楊昱萍，李 珍，劉建青

（包頭師范學院生物科學與技術學院，內蒙古包頭 014030）

牛呼吸道合胞體病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）是單分子負鏈RNA病毒目（Mononegavirales）的成員，主要侵害牛的呼吸道，臨床可見咳嗽、呼吸急迫、流淚、流鼻液及流涎等癥狀（Mathieu等，2007）。BRSV還可導致牛的白血球減少癥，乳牛泌乳量顯著減少，甚至停止，懷孕母牛發生流產等，給養牛業造成很大的經濟損失（馮軍科等，2010）。因此，快速檢測牛場BRSV具有重要意義。

隨著科學技術的發展，檢測BRSV的成熟方法有好幾種，主要有免疫學檢測、病毒的細胞培養法、電子顯微鏡觀察病毒粒子及RT-PCR檢測法（Ulrike等，2002）。由于BRSV接種到細胞上大約5 d才會出現病變，多數情況下病變并不明顯，且不易觀察，嚴重影響該方法的檢出率。此外，盡管電子顯微鏡觀察病毒粒子用時較短，但敏感性不高。相反，RT-PCR是一種高效、敏感、穩定的檢測方法，是實驗室檢測BRSV最常用的方法（Juan等，2001）。提取病毒核酸，利用Primer5.0設計特異性檢測引物是該方法的關鍵。本研究旨在建立一種RT-PCR方法，能快速、有效地檢測BRSV，為防治BRSV提供相應幫助。

1 材料與方法

1.1 毒株及對照細胞 牛呼吸道合胞體病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛副流感病毒3型、口蹄疫病毒、MDBK細胞均由本實驗室保存。

將BRSV接種到長成單層MDBK細胞上，當細胞發生明顯病變時收獲病毒液，-70℃保存備用（Philip等，2006）。

1.2 常規試劑與RT-PCR試劑 購自北京化工有限公司和大連寶生物公司。

1.3 引物的設計與合成 根據已發表的BRSV各毒株的全序列，選擇保守性較強的N基因，利用Primer 5.0設計合成了一對特異性引物，由Invitrogen（北京）公司合成。引物序列如下：

上游引物：

下游引物：

1.4 病毒RNA的提取 按照Trizol Reagent 試劑的說明提取BRSV總RNA（Prozzi等，1997）。

主要步驟如下：

（1）吸取樣品250 μL，加入Trizol Reagent裂解液750 μL，顛倒混勻，室溫放置5 min。

（2）加 入200 μL氯 仿，混 勻，室 溫 放 置5 min。

（3）4℃，12000 r/min離心10 min。

（4）取600 μL水層液體至新的、DEPC處理過的1.5mL離心管中，然后加入600 ul異丙醇，室溫靜置30 min。

（5）4℃，12000 r/min離心10 min。

（6）倒掉上清，用1000 μL 75% DEPC冰乙醇洗滌。

（7）12000 r/min，4℃，離心10 min。

（8）倒掉乙醇，置于通風櫥中干燥20 min。

（9）加入20～30 μL DEPC水溶解。

（10）-80℃保存。

1.5 反轉錄合成cDNA 吸取4 μL RNA提取液于離心管中，加入2 μL Random Primers、5 μL DEPC水、4 μL 5×Buffer、3 μL 10mmol/L dNTPs、1 μL Rnasin（40U/μL）、1 μL AMV，總 體 積20μL。42℃水浴1 h（Valarcher等，1999）。

1.6 PCR擴增反應 在反應體系中依次加入2μL cDNA、16 μL超 純 水、2.5 μL 10×Buffer、上游下游引物各1 μL、2 μL dNTPs、0.5 μL E Taq，總體積是25 μL。PCR反應條件是95℃預變性5 min、94℃變性30 s，47℃ 30 s，72℃延伸30 s，30個循環，72℃充分延伸10 min。

1.7 PCR產物的檢測 PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 RT-PCR特異性與敏感性檢測 取BRSV細胞培養物、牛病毒性腹瀉病毒、牛副流感病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒3型病毒、口蹄疫病毒、MDBK正常細胞培養物，分別提取RNA進行RTPCR，進行電泳。將BRSV的細胞培養物提取RNA并且定量，進行10倍梯度稀釋，分別進行RT-PCR，電泳，觀察試驗結果。

1.9 臨床應用 采集38份臨床癥狀類似BRSV引起流鼻液的鼻拭子樣品，應用上述方法進行RT-PCR檢測。

2 結果

2.1 BRSV在MDBK細胞上產生病變 由圖1a，圖1b可知，將BRSV接種于MDBK細胞，5 d后細胞變圓、變大，聚集成團，產生明顯病變。

圖1a BRSV在MDBK細胞上的病變圖

圖1b 正常MDBK細胞

2.2 RT-PCR 擴增結果 由圖2可知，本方法擴增出特異性目的條帶的大小為287 bp。

圖2 RT-PCR擴增結果

2.3 RT-PCR 特異性擴增結果 由圖3可知，將BRSV細胞培養物、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛副流感病毒3型病毒、口蹄疫病毒、MDBK正常細胞培養物分別提取RNA進行RT-PCR，結果只有BRSV的細胞培養物能擴增出目的條帶，其他對照組均沒有擴增出任何條帶。

圖3 特異性實驗結果

2.4 RT-PCR敏感性試驗結果 由圖4可知，對不同濃度的RNA進行RT-PCR擴增，結果發現本方法能檢測出1 pg的病毒RNA。

圖4 敏感性實驗結果

2.5 RT-PCR檢測鼻拭子樣品的結果 對采集的38份臨床癥狀類似BRSV引起流鼻液的鼻拭子樣品進行檢測，結果有10份樣品出現了287 bp的目的條帶。

3 討論

（1）本試驗的技術關鍵是BRSV核酸提取質量，在試驗過程中要有一個清靜的環境，盡可能降低Rnase對病毒RNA的降解（高存福等，2007）。在PCR實驗過程中，對退火溫度做了梯度試驗，在46～49℃之間均能擴增出目的條帶，其中47℃時效果最好。

（2）根據已發表的BRSV序列，在其N基因上的保守區域設計合成了一對特異性引物，對本實驗室分離的BRSV進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果與預期結果一致，證明該檢測方法可以快速準確地對牛呼吸道合胞體病毒病作出診斷。

（3）PCR的敏感性試驗證明該方法可以檢測到1pg的病毒RNA，與國外文獻報道的結果非常接近，說明該RT-PCR檢測方法具有很高的敏感性。經過3次重復實驗，得到相同的試驗結果，說明該試驗方法具有很強的操作性，為臨床上快速診斷牛呼吸道合胞體病毒提供了一個可靠的方法。

（4）本實驗建立的RT-PCR方法可以直接從牛鼻拭子樣品中檢測出BRSV。從內蒙某牛場采集了38份疑似病例樣品，應用此方法檢測出10份樣品為陽性，表明BRSV存在于規模化牛場中，為該病預防提供了幫助，有助于降低由該病造成的經濟損失。